隨著醫學及生物學研究的飛速發展，越來越多的科研人員希望將分子及細胞生物學技術從傳統的體外研究延伸到活體動物體內，以期直接監控活體生物體內的細胞活動和基因表達，有效地研究觀測轉基因動物生理過程，譬如活體動物體內腫瘤的生長及轉移、感染性疾病發生發展過程等�；铙w動物光學成像技術作為新興的成像技術以其操作簡單、結果直觀、靈敏度高、成本低等特點，成為活體動物成像的一種理想方法。

活體動物體內光學成像分為生物發光和熒光兩種技術。生物發光是利用熒光素酶基因標記目的核酸和細胞，在ATP和氧氣存在時，通過熒光素酶催化經過腹腔或者靜脈注射的底物熒光素，實現發光過程。所以生物發光只有在活細胞中才具有發光現象；而熒光技術則是采用熒光報告基團標記多肽、抗體、小分子藥物，在外界光源的激發下產生熒光。雖然目前的活體動物體內成像以生物發光應用居多，但是就人類疾病臨床追蹤治療以及后續的相關應用方面，生物發光存在著自身的缺陷。和熒光成像相比，生物發光遠遠弱于熒光信號，而且光在動物組織內的傳播會被散播和吸收，這就意味著應用生物發光技術的檢測儀器，需要高靈敏度的檢測儀器，成本非常昂貴。同時，生物發光幾乎都是酶-底物類型的反應，需要涉及不同種類轉基因細胞株或轉基因動物模型，復雜程度較高，所以和熒光技術相比，更容易受基質中的成分影響(通常是淬滅)。而傳統熒光技術作為臨床研究潛在的有力工具，自身的不足在一定程度上阻礙了在活體動物體內成像的應用：

1. 自發熒光干擾
在以往的可見光激發光源下，活體小動物通常會產生較強的自發熒光，這些自發熒光主要是來源于皮毛(黑色素)和血液(血紅蛋白)。

2. 光的組織吸收特性
熒光成像時，光在動物組織內傳播時會被折射和吸收，而且不同類型的細胞和組織對光子的吸收能力不同。這就直接導致了特異熒光信號的衰減，無法捕獲完整的活體動物體內的真實信息。

3. 靈敏度較低
檢測過程中由于活體小動物產生的自發非特異性熒光會影響到檢測靈敏度，特別是當發光細胞位于組織內部，則需要較高能量的激發光源，與此同時也就會產生較強的背景噪音，導致檢測靈敏度下降。

針對以上傳統熒光成像技術的不足，美國LICOR公司基于紅外熒光檢測技術開發了Pearl Imager活體成像系統，其獨特的近紅外熒光成像優勢極大推廣了活體動物熒光檢測的應用發展：

* 極低的自發熒光干擾
通�；铙w動物的自發熒光來源于皮毛(黑色素)和血液(血紅蛋白)，而黑色素的發光光線波長峰值一般在500-520nm左右，血紅蛋白的發光光線波長峰值一般在504-540nm左右，這都說明在可見光波長熒光下進行成像檢測，活體動物自發產生的非特異熒光不可避免。但是在大于600nm的紅光、近紅外波段，黑色素、血紅蛋白等物質的自發非特異熒光極低，所以采用近紅外熒光作為外源激發光源，活體內物質的自發熒光對于成像干擾小，背景噪音低，靈敏度高，而Pearl Imager正是這樣的活體成像系統。

* 良好的組織滲透性
生物組織在可見光范圍（350～600 nm）及在紅外線范圍（>900nm）有較高的光吸收，而在近紅外區域（600～900nm）生物分子的光吸收降到*低，大量的光可以穿過組織和皮膚而被檢測到。Pearl ImagerTM 采用近紅外熒光檢測系統，使得組織滲透性深度從原來的幾毫米上升到幾厘米，而且紅光的穿透性在體內比藍綠光的穿透性要好得多，尤其以近紅外熒光為觀測生理指標的*佳選擇。

* 無毒性和放射性，游離熒光染料清除快
近紅外熒光染料基團對小動物活體無危害，不具有放射性，而且游離的熒光基團可以在短時間內在動物體內淬滅清除，方便后續*優化檢測。所以采用Pearl Imager活體成像系統可以真正無損傷地研究活體實驗動物體內的各種生理指標，數據結果真實可靠。

由此可見，近紅外熒光自身固有的特點恰好彌補了傳統熒光技術的弱點，另外利用熒光技術進行活體動物體內成像本身又具有諸多的優勢，主要表現在：

1. 基團標記能力強
目前熒光標記物種類繁多，包括熒光蛋白、熒光分子、量子點等，可以與基因、多肽、抗體等生物分子標記，使用范圍廣。同時不同的熒光蛋白或染料還可對樣本進行多重標記，同時成像。Pearl Imager活體成像系統可以進行雙重標記，雙通道同時檢測，并且相隔100nm的檢測波長保證了數據采集不互相干擾，保證了成像結果真實有效。

2. 信號強度大
由于熒光是在外界光源激發下產生的能量轉移現象，其信號更強，持續時間更長，反映更多的活體信息，并且對檢測器的要求相對較低，節省實驗成本。

3. 成像材料廣
由于熒光是基于物理能量轉移原理，對成像樣本的生理狀態要求較低。Pearl Imager可以實現活體、尸體、尸解組織器官樣本的光學成像。

4. 快速成像，每次檢測時間僅為毫秒級，同時可檢測多個動物
Pearl Imager活體成像系統可以在30秒內(一般20秒)完成對活體動物白光，雙通道熒光(700nm和800nm)的成像，并且自動生成雙通道的疊加圖象，極大減少對于活體的傷害，獲得更為豐富真實的信息圖片。 美國LICOR公司的Pearl Imager小動物活體成像系統由于采用了近紅外熒光檢測技術，所以在秉承了熒光技術傳統特點的同時又彌補了原先技術的不足，推動了熒光成像技術在臨床疾病的研究。

另外，LICOR公司針對于Pearl Imager活體成像系統，還推出了一系列相應的熒光染料基團和探針，極大方便了廣大研究人員的應用研究。

1. IRDye® 800CW 2-DG Optical Probe
癌細胞與正常細胞相比通常會表現出代謝異常，如糖酵解過程異常。研究人員以往利用葡萄糖的類似物，如18F-2-deoxy-D-glucose (18FDG)進行正電子發射斷層掃描（PET）觀察原癌的發生和轉移的研究。但是在利用活體小動物體進行腫瘤研究時候，帶放射性標記的2-脫氧-D-葡萄糖顯然不是一個合適的標記物，而IRDye® 800CW 2-DG Optical Probe作為熒光光學成像介質則可以成為一個有效的替代品，直接應用于實驗動物腫瘤生物學的研究中。IRDye® 800CW 2-DG Optical Probe探針的*大吸收波長為774nm，*大發射波長為789nm，結合Pearl ImagerTM成像系統可以從事相關的糖酵解過程的觀察研究。而且這種光學探針的有效性在多種腫瘤細胞中已經得到有效的驗證，如A431（圖1.），SW620，22Rv1，PC3M-LN4以及3T3-L1。

圖1 . 利用Pearl Imager活體成像系統結合10 nmol的IRDye® 800CW 2-DG探針檢測A431皮下腫瘤的示意圖（顯示的探針信號為小鼠白光的灰度圖和偽彩的合并圖）

2. IRDye® BoneTag® Optical Probe
IRDye® BoneTag® 光學探針分為IRDye 680 Bone Tag 以及 IRDye 800CW Bone Tag兩種（圖2.），探針的*大吸收波長分別為676nm和774nm，*大發射波長分別為698nm和789nm，分別對應于Pearl ImagerTM 系統的700nm通道和800nm通道。這種探針的原理是將鈣螯合化合物與近紅外熒光基團IRDye 680或者IRDye 800CW 結合，主要用于動脈鈣化，骨骼生長，骨骼形態異常等研究。近紅外熒光基團的結合并不會影響鈣螯合物的結合功能，相反，由于結合了近紅外染料增強了研究效率。

圖2. Pearl Imager獲得的通過靜脈注射IRDye 680 Bone Tag探針50小時后的影像

3. IRDye® 800CW EGF Optical Probe
表皮生長因子受體（EGFR）是在表皮細胞中發現的酪氨酸激酶受體家族中的成員，可以和表皮生長因子（EGF）特異結合。在很多腫瘤細胞中，經常會在細胞表面觀察到異常高含量的表皮生長因子受體（EGFR）。因此，利用表皮生長因子（EGF）結合情況可以觀察體內體外的腫瘤發生發展情況。與IRDye® BoneTag® Optical Probe 類似，IRDye® 800CW EGF Optical Probe是將表皮生長因子（EGF）和紅外熒光染料IRDye 800CW 結合所形成探針（圖3.）。

圖3. 利用不同的熒光標記物分析兩種細胞系中超表達表皮生長因子受體（EGFR）
a. 利用IRDye 800CW EGF的結果；
b. 利用IRDye 800CW的結果；
c. 使用另一種探針的結果。
以上三張圖可以表明，IRDye 800CW EGF探針的效果明顯要優于競爭產品，而b圖同樣表明，IRDye 800CW對于表皮生長因子（EGF）的功能沒有任何影響(http://www.licor.com/bio/IRDye/800CW_EGF_op_probe.jsp)。

4. IRDye® 800CW Carboxylate
這種探針介質是LICOR公司開發的針對于近紅外熒光基團標記物的對照染料介質，它不會影響其他物質的功能，是一種非常有效的質控介質。

綜上所述，體內熒光成像技術可以展示活體實驗小動物中熒光基團的熒光發射狀況，結合日益完善的各種熒光探針，使其正在成為醫學基礎研究和臨床疾病應用之間聯系的重要樞紐。美國LICOR公司的Pearl Imager活體成像系統結合了傳統熒光技術以及近紅外熒光的特點，輔助于高特異性和高靈敏度的探針，實現對于活體實驗小動物的成像，并在這基礎上，正逐步應用于分子靶點和臨床疾病的研究，癌癥的發生發展，藥物治療的效果，還進一步應用于病毒學，siRNA，干細胞研究，轉基因動物模型構建，蛋白質相互作用以及細胞體外檢測等領域。