簡介

人們嘗試過很多方法將質(zhì)粒DNA導(dǎo)入細(xì)胞，常用的有DEAE右旋糖苷，磷酸鈣沉淀，脂質(zhì)體，顯微注射和電擊等物理方法。現(xiàn)有的轉(zhuǎn)染技術(shù)都或多或少的有各種不足，其中轉(zhuǎn)染效率低，細(xì)胞毒性高是研究者最常遇到的困擾；而許多細(xì)胞系，特別是原代細(xì)胞是很難獲得理想的轉(zhuǎn)染效果的。現(xiàn)有的轉(zhuǎn)染試劑產(chǎn)品在應(yīng)用中還有一個普遍的問題，就是不太可能采用單一一種試劑在各種細(xì)胞上都獲得較高轉(zhuǎn)染效率；因此研究者不得不嘗試很多種類的轉(zhuǎn)染試劑而獲得特定細(xì)胞的最佳轉(zhuǎn)染效果。如果某種轉(zhuǎn)染試劑盒可以在各種細(xì)胞——包括哪些“抗拒轉(zhuǎn)染”的細(xì)胞¬——的轉(zhuǎn)染實驗中都能獲得好結(jié)果，對于廣大研究者來說將是一個福音。

為了達(dá)到研究者的這種期望，默克Novagen經(jīng)驗豐富的研究團(tuán)隊開發(fā)了NanoJuice™轉(zhuǎn)染試劑盒，其兩種組分互相促進(jìn)，可以提高各種哺乳動物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果。采用最新的納米科學(xué)技術(shù)Priostar® dendrimers（樹枝狀聚合物） 和多價陽離子脂質(zhì)體的特別設(shè)計，NanoJuice轉(zhuǎn)染試劑混合物可以確保獲得卓越的轉(zhuǎn)染效率而細(xì)胞毒性極低。這種新的轉(zhuǎn)染方法會幫助研究者在原代細(xì)胞和那些“頑固抵抗轉(zhuǎn)染”的細(xì)胞上輕易獲得成功。NanoJuice試劑盒中的兩種試劑經(jīng)過調(diào)節(jié)配比，很方便為不同的細(xì)胞設(shè)定最佳轉(zhuǎn)染效果的使用方法。有了NanoJuice轉(zhuǎn)染試劑盒就再也不需要不斷地為每一種細(xì)胞從頭摸索不同轉(zhuǎn)染方法或嘗試各種產(chǎn)品了。我們建議您采用預(yù)試驗為特定的細(xì)胞找到最佳試劑用量，通常這個小試可以在24孔板中進(jìn)行；一旦最優(yōu)化的轉(zhuǎn)染試劑用量確定了，后續(xù)的操作可以在此基礎(chǔ)上非常方便地用等比縮放來輕松獲得穩(wěn)定的高效轉(zhuǎn)染。

確定最佳轉(zhuǎn)染條件預(yù)實驗

我們在一些原代細(xì)胞和其它較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上做了預(yù)試驗，以便摸索試劑的最佳用量和配比。每個試驗設(shè)定6種條件，包括每ug DNA采用2種不同用量的NanoJuice核心轉(zhuǎn)染試劑和4種不同用量的轉(zhuǎn)染增強(qiáng)試劑（圖1）。通常，NanoJuice的最適使用量范圍是：核心轉(zhuǎn)染試劑1-2ul / ug DNA，轉(zhuǎn)染增強(qiáng)試劑1-4ul / ug DNA。預(yù)試驗結(jié)果顯示，每種細(xì)胞的最佳轉(zhuǎn)染效果采用的兩種轉(zhuǎn)染試劑成分的比例可能差別甚大（圖2）。我們的嘗試表明每一種細(xì)胞均需設(shè)置預(yù)試驗以獲得最優(yōu)化的實驗條件，同時這些數(shù)據(jù)也證明了NanoJuice™轉(zhuǎn)染試劑盒是一種多功能轉(zhuǎn)染工具，可以作為各種細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染的首選。不斷在各種細(xì)胞上嘗試NanoJuice轉(zhuǎn)染試劑盒發(fā)現(xiàn)其兩種試劑成分的用量可以根據(jù)不同細(xì)胞的實際情況有更大幅度的調(diào)整。例如：Caco-2細(xì)胞的預(yù)試驗中，NanoJuice核心轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染增強(qiáng)試劑都是1ul / ug DNA。而進(jìn)一步的嘗試發(fā)現(xiàn)兩種試劑的用量可以更低一些，分別為1ul和0.75ul，而轉(zhuǎn)染效率有小幅提高（圖3）。

圖1 確定最佳轉(zhuǎn)染條件的預(yù)實驗，嘗試8種轉(zhuǎn)染核心試劑與轉(zhuǎn)染增強(qiáng)試劑的不同配比，每種做3個重復(fù)。

圖2 預(yù)實驗
轉(zhuǎn)染前18-24h在24孔板接種細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時細(xì)胞融合度為60-90%。每3個重復(fù)的孔需準(zhǔn)備：核心轉(zhuǎn)染試劑0.9-1.8ul，轉(zhuǎn)染增強(qiáng)試劑0.9–3.6ul，在70ul無血清培養(yǎng)基中稀釋，室溫孵育5min。圖中標(biāo)明每ug DNA所采用的NanoJuice核心轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染增強(qiáng)試劑的不同用量（ul）。轉(zhuǎn)染采用克隆了Renilla熒光素酶報告基因的pTriEx-5重組子，每孔DNA用量為0.9ug。質(zhì)粒上帶有CMV啟動子，N端Strep•Tag® II標(biāo)簽，Rluc報告基因和C端His•Tag®標(biāo)簽。轉(zhuǎn)染混合物在室溫下孵育15min。每孔加入轉(zhuǎn)染混合物20ul。24-72h后，以100ul Reportasol™試劑抽提。10ul細(xì)胞抽提液中Rluc的活性采用試劑盒MightyLight™ 分析。統(tǒng)計每孔相對光單位(RLU/well)，3個重復(fù)取平均值。

圖3 進(jìn)一步優(yōu)化實驗
轉(zhuǎn)染前18-24h在24孔板接種細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時細(xì)胞融合度為60-90%。每3個重復(fù)的孔需準(zhǔn)備：核心轉(zhuǎn)染試劑0.68-0.9ul，轉(zhuǎn)染增強(qiáng)試劑0.45–0.9ul，在70ul無血清培養(yǎng)基中稀釋，室溫孵育5min。圖中標(biāo)明每ug DNA所采用的NanoJuice核心轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染增強(qiáng)試劑的不同用量（ul）。用于轉(zhuǎn)染的報告重組子同圖2實驗，每孔DNA用量為0.9ug。轉(zhuǎn)染混合物在室溫下孵育15min。每孔加入轉(zhuǎn)染混合物20 ul。48h后，以100ul Reportasol™試劑抽提。10ul細(xì)胞抽提液中Rluc的活性采用試劑盒MightyLight™ 分析。統(tǒng)計每孔相對光單位（RLU/孔），3個重復(fù)取平均值。

卓越的轉(zhuǎn)染效果

分別確定了NanoJuice試劑的最佳用量和配比后，我們嘗試在后續(xù)實驗中，分別轉(zhuǎn)染了Saos-2，Caco-2，Raw264.7，Jurkat和動脈平滑肌細(xì)胞。同時以市售的其它轉(zhuǎn)染試劑做對照（按廠家提供的產(chǎn)品說明書操作），實驗結(jié)果（圖4）顯示，由優(yōu)化的NanoJuice混合試劑轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表達(dá)Renilla 熒光素酶的產(chǎn)量明顯高于其它轉(zhuǎn)染方法。另外，我們也比較了NanoJuice與GeneJuice®轉(zhuǎn)染試劑對于Caco-2，Raw264.7和Saos-2細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染效果（圖5）。對于那些轉(zhuǎn)染較為困難的細(xì)胞系，NanoJuice轉(zhuǎn)染試劑盒獲得的Renilla 熒光素酶表達(dá)產(chǎn)量均高于GeneJuice轉(zhuǎn)染試劑。

圖4 NanoJuice與其它轉(zhuǎn)染試劑的比較
轉(zhuǎn)染前18-24h在24孔板接種細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時細(xì)胞融合度為60-90%。轉(zhuǎn)染操作按廠家說明書進(jìn)行。用于轉(zhuǎn)染的報告重組子同圖2實驗，NanoJuice轉(zhuǎn)染試劑采用圖2實驗中確認(rèn)的每種細(xì)胞的相應(yīng)最佳用量。（圖中顯示每ug DNA所用的兩種NanoJuice試劑用量ul）24–48h后, 以100ul Reportasol™試劑抽提。10ul細(xì)胞抽提液中Rluc的活性采用試劑盒MightyLight™ 分析。統(tǒng)計每孔相對光單位（RLU/孔），3個重復(fù)取平均值。

圖5 NanoJuice與GeneJuice轉(zhuǎn)染“困難”細(xì)胞的結(jié)果比較
兩種來自Novagen的DNA轉(zhuǎn)染試劑用于轉(zhuǎn)染Caco-2，Raw264.7和Saos-2細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前18-24h在24孔板接種細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時細(xì)胞融合度約為80%。按圖2和4的條件轉(zhuǎn)染。兩種NanoJuice試劑的用量采用圖2實驗的最佳用量。3個重復(fù)取平均值。

細(xì)胞毒性討論

成功轉(zhuǎn)染的另一個關(guān)鍵是細(xì)胞毒性低。細(xì)胞受損的表現(xiàn)包括形態(tài)上變圓或細(xì)胞不再貼壁等。轉(zhuǎn)染48小時后拍攝的照片中Saos-2細(xì)胞非常健康，在同類產(chǎn)品中細(xì)胞毒性最低（圖6）。

圖6 毒性比較
NanoJuice轉(zhuǎn)染，其它轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染和無轉(zhuǎn)染陰性對照的細(xì)胞毒性比較。采用Saos-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染，每實驗3個重復(fù)。轉(zhuǎn)染48h后拍照。
左上：陰性對照；右下：NanoJuice轉(zhuǎn)染；
下圖為兩種常見市售轉(zhuǎn)染試劑的細(xì)胞毒性實驗。

小結(jié)

NanoJuice轉(zhuǎn)染試劑盒易于優(yōu)化而獲得各種細(xì)胞的最佳轉(zhuǎn)染效果，包括那些原代培養(yǎng)細(xì)胞和轉(zhuǎn)染極為困難的細(xì)胞。同時，NanoJuice轉(zhuǎn)染試劑細(xì)胞毒性很低，與含有或沒有血清的培養(yǎng)基兼容，適用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和瞬時轉(zhuǎn)染，操作簡便而不需要更換培養(yǎng)基。該產(chǎn)品采用無動物源性生產(chǎn)，保障您在嚴(yán)格限制動物來源試劑領(lǐng)域的使用。

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• NanoJuice轉(zhuǎn)染核心試劑和轉(zhuǎn)染增強(qiáng)試劑可單獨購買，貨號分別為71900和71901。
  
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