Western blot的原理很簡單，不外乎抗原抗體、酶和底物間的相互作用；實驗過程也并不復雜，主要就是摸索轉(zhuǎn)膜時間、抗體濃度。然而，western blot聽上去還是像個浩大工程，為什么？因為它每個步驟耗費的時間都很長。想當年，一切都是自己動手的時候，配膠、跑膠、轉(zhuǎn)膜、封閉、雜交、檢測，這些步驟起碼要花一天的時間，還得起早摸晚的。有時候結果不理想，那可真是無比沮喪。后來，有了預制膠，配膠的功夫省了，實驗重復性也上了一個小臺階。再后來，Invitrogen推出了iBlot干轉(zhuǎn)儀，轉(zhuǎn)膜只要7分鐘，工作效率再次提高。但western的檢測仍然是個乏味且耗時的工作，孵育、洗滌、孵育、洗滌……不知不覺，3小時已悄悄溜走。

為了進一步提高western blot的效率，Invitrogen最近又推出了iBlot® Western檢測試劑盒，它可是iBlot干轉(zhuǎn)儀的好搭檔。它們倆密切配合，能將western檢測從3小時縮短到25分鐘。這其中的奧秘就是iBlot系統(tǒng)利用電場將帶電荷的蛋白（一抗、二抗）迅速轉(zhuǎn)移到膜上，從而加速了抗原-抗體的結合。以往1小時的抗體孵育現(xiàn)在3分鐘就能搞定，而且封閉與一抗孵育是同步完成的。這是因為一抗稀釋液中含有高濃度的蛋白，其濃度要比一抗高出3-4個數(shù)量級，所以非特異性結合可以忽略不計。也有可能是封閉蛋白的分子量比較小，在電場作用下跑得更快。

下圖顯示了iBlot系統(tǒng)的工作原理。其中淺綠色的就是抗體基質(zhì)，抗體在電場作用下轉(zhuǎn)移到膜上。

抗體轉(zhuǎn)膜的過程與蛋白轉(zhuǎn)膜相似，只要將這些材料按順序摞好，趕走氣泡就行了。千萬不要把順序搞反了。具體的操作步驟如下：

1. 將綠色的抗體基質(zhì)放置在透明薄板上。利用一個干凈的移液器，將一抗溶液均勻地加在基質(zhì)上。迷你膠約需3-5 mL；標準膠需7-9 mL。如果你想嘗試不同的抗體濃度，也可以將基質(zhì)剪開，分別加上不同濃度的抗體，并用試劑盒自帶的Spacer隔開。

2. 移去iBlot® Western檢測陽極堆積層（底部）上的封膜。將裝有陽極堆積層的塑料托盤直接放置在轉(zhuǎn)印表面。將托盤與右側(cè)的凝膠擋板對齊。

3. 用鑷子將潤濕的膜放在陽極堆積層上，并利用轉(zhuǎn)印滾筒趕走氣泡。

4. 用鑷子將抗體浸潤的基質(zhì)放在膜上。利用轉(zhuǎn)印滾筒趕走氣泡。

5. 移去iBlot® Western檢測陰極堆積層（頂部）上的封膜。將陰性堆積層放在綠色基質(zhì)上，電極一面朝上。利用轉(zhuǎn)印滾筒趕走氣泡。

6. 選擇程序P7，設定轉(zhuǎn)移時間為3分鐘。

7. 對于二抗，重復步驟1-6。

8. 在第二次轉(zhuǎn)移過程之后，洗滌膜，接著進行檢測。

檢測步驟與常規(guī)的western相同。試劑盒中提供了抗小鼠或抗兔的二抗，與化學發(fā)光和顯色檢測兼容。除此之外，iBlot Western檢測試劑盒還提供了western檢測所需的所有溶液——抗體稀釋液、洗滌液、檢測底物（化學發(fā)光或顯色）以及iBlot® 檢測堆積層。你唯一需要自備的試劑就是一抗。

說了這么多，大家最關心的肯定還是實驗結果。又快又好，那才是大家所希望的。下圖是iBlot® Western檢測試劑盒與WesternBreeze®試劑盒的比較。利用iBlot® 干式轉(zhuǎn)印系統(tǒng)將來自SW480（人結腸腺癌細胞系）裂解物的蛋白轉(zhuǎn)印。小鼠抗-p53抗體作為一抗。檢測分別由(A) WesternBreeze® 化學發(fā)光試劑盒-抗小鼠或(B) iBlot® Western檢測試劑盒（抗小鼠）來進行。實驗表明，iBlot® 試劑盒檢測蛋白的靈敏度與WesternBreeze® 試劑盒相當。

預制膠+iBlot干式轉(zhuǎn)印儀+iBlot Western檢測試劑盒，這真是個完美的組合，western blot能一下子從一天縮短到2個小時，工作效率大大提高。但通常省時省事的產(chǎn)品都不省錢，這個也不例外，適合10次mini膠檢測的試劑盒（含PVDF膜）價格在4000多，其實光看堆積層中的銅電極，就知道價格不菲。對于那些不差錢的實驗室來說，為了趕進度、發(fā)好文章，或許也是值得的。

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（生物通 余亮）