眾所周知，天然的DNA復制本身就是一個非常高效且準確的過程。真核生物DNA復制的速度達幾十個核苷酸/秒。若能以這樣的神速測序，那可比Sanger測序快了幾萬倍。然而，知易行難。如何在不影響聚合酶活性的前提下實時觀察DNA合成，這可是個棘手的問題。要知道，DNA聚合酶的直徑只有15 nm。而且，這是一個涉及酶學、表面化學和檢測光學的多學科難題。

早在10多年前，美國康奈爾大學的研究生Steven Turner和Jonas Korlach就開始為解決這一難題而做出不斷努力。如今，Korlach和Turner創辦了一家名為Pacific Biosciences（以下簡稱PacBio）的公司，并且終于將他們的想法轉變成為現實產品。讓我們看看他們主要克服了哪些挑戰。

實時觀察DNA聚合酶的主要挑戰之一是如何能在DNA合成期間檢測到單個核苷酸的摻入。因為在顯微鏡實時記錄DNA鏈上熒光的時候，周圍眾多的熒光標記的核苷酸形成了非常強大的熒光背景。這種強大的熒光背景使單分子的熒光探測成為不可能。正在他們一籌莫展之際，突然，微波爐門給了他們啟發。微波爐門上的金屬篩布滿了小洞，它們比微波的波長要小得多。因此，這些洞能阻止微波通過并穿透玻璃。然而，波長更小的可見光就能夠通過，讓我們看到食物。他們的SMRT技術應用了相同的原理，不過規格就縮小至納米級，稱之為ZMW（zero-mode waveguide，零模式波導）。

ZMW是一個直徑為幾十納米的小孔，它阻止可見的激光（波長大約為600 nm）完全透過ZMW。激光在進入ZMW后迅速衰減，因此，只有底部30 nm被照亮（下圖）。在每個ZMW中，單個DNA聚合酶分子利用專利技術錨定在底部玻璃的表面。隨后核苷酸涌入ZMW中，并在陣列表面擴散。當聚合酶檢測到正確的核苷酸時，便將其摻入新生鏈中，這個過程需要幾毫秒，而單純的擴散只需要幾微秒。這種時間差使摻入的核苷酸產生了很高的信號強度，類似于脈沖信號。因此，ZMW有能力在熒光標記核苷酸的背景下檢測單個摻入事件。

測序是在專利的SMRT Cell中開展的，每個Cell中有一個陣列，上面有15萬個ZMW。每個ZMW都能夠包含一個DNA聚合酶及一條不同的DNA樣品鏈。每次運行能夠平行檢測大約75,000個單分子測序反應。

Korlach與Turner還有一項重大發明。傳統的核苷酸標記方法是將熒光標記連接到核苷酸的堿基上，也就是摻入DNA鏈中。這對于實時觀察DNA合成也是有問題的，因為大分子的染料會干擾DNA聚合酶的活性，或造成聚合反應提前終止。因此，Korlach和Turner就開發出一種新型的核苷酸標記方法，即在核苷酸的磷酸鏈上進行標記，而不是堿基，這樣，一旦核苷酸摻入到新生DNA鏈中，標記基團就會自動脫落。

當然，要將ZMW中的反應記錄下來，還需要一臺高精尖的儀器。PacBio RS于是誕生了，它能夠實時開展、監控并分析單分子生化反應。PacBio RS使用一個大孔徑物鏡和四個單光子照相機來收集熒光所發射的光脈沖，觀察整個過程；并使用一套優化的算法，將光學系統所捕獲的信息翻譯成ACGT堿基。一旦測序開始，實時的數據就傳送到初步分析流水線，生成堿基身份和質量值。

以上三種新技術結合，就能讓研究人員在短短的幾分鐘內對長片段DNA進行測序。它的速度、讀長、靈活性和費用讓其從第三代測序中脫穎而出。從樣本制備到測序，所需的時間還不到一天。典型的測序運行時間低至30分鐘。序列數據在幾分鐘之內就能產生，而不是幾天，這對于傳染病監控和分子病理學尤為重要。PacBio RS目前的讀長超過1kb，比第二代測序要長得多。此外，試劑消耗和樣本制備極少，不需要常規的PCR擴增，失誤也大大減少，聚合酶動力學的直接觀察賦予了測序之外的更多應用。憑借這些優勢，PacBio今年被美國麻省理工學院（MIT）的《技術評論》（Technology Review）雜志評為全球50家最具創新力的企業之一。

一系列的文章也證明了SMRT技術。Korlach與Turner于2009年2月在《科學》雜志上發表了一篇介紹PacBio單分子DNA測序技術的文章。這篇文章代表了首個第三代測序技術的“原理驗證”，因此引用率非常高。而后，他們又利用SMRT技術，直接測定了DNA的甲基化，這相對目前流行的第二代測序技術又前進了一大步。文章發表在今年5月的《Nature Methods》上。

熒光脈沖的到達時間和持續時間反映了有關聚合酶動力學的信息，從而允許直接檢測DNA模板鏈中的修飾核苷酸，包括N6-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶和5-羥甲基胞嘧啶。各種修飾對聚合酶動力學的影響不一，從而能夠將它們區分開。研究人員使用這些動力學特征，鑒定出基因組樣品中的腺嘌呤甲基化，并發現再結合circular consensus sequencing，他們能夠在單堿基分辨率上鑒定出表觀遺傳學修飾（mA、mC和hmC）。研究人員還預計，其它的表觀遺傳學修飾，以及各種形式的DNA傷害，也能用這種方法檢測。

看到這里，大家可能迫不及待地想知道PacBio的測序儀何時上市，價格多少。其實，PacBio RS已成型，目前正在早期試用階段。今年2月份，PacBio宣布了10位北美的早期試用客戶，包括貝勒醫學院、冷泉港實驗室、美國能源部聯合基因組研究所、華盛頓大學基因組中心和斯坦福大學等等，并與第二季度開始發貨。8月份，PacBio又迎來了它的首位歐洲試用客戶，大名鼎鼎的Wellcome Trust Sanger研究院。

整個測序系統包括PacBio RS儀器以及專利的耗材。耗材部分包括SMRT Cell和試劑盒。PacBio RS上的每個反應消耗一個SMRT Cell。8個SMRT Cell包裝成8Pac的形式。另外，他們還提供了三種試劑盒，用途各不同。Template Preparation Kit將DNA轉化成SMRTbell文庫形式。Binding Kit則將這個文庫與聚合酶結合，為測序做準備。Sequencing Kit包含了實時測序所需的試劑。每個樣本可在單個SMRT Cell上測序，也可根據項目需求在多個SMRT Cell中測序。因此，每個反應的價格取決于實驗設計。

PacBio預計，到2013年，個人基因組的測序能在15分鐘內完成，費用低于1000美元，人人都可以消費得起。說實話，2008年我第一次聽到這個消息時，心中飽存疑惑，看來我實在是低估了PacBio的實力，也低估了測序技術發展的腳步。（生物通 余亮）