DNA甲基化參與了多個生物過程的調節，自然也就成了目前研究的熱點。DNA甲基化檢測的方法有很多種，但大多離不開亞硫酸氫鹽轉化。亞硫酸氫鹽轉化是將序列中未甲基化的胞嘧啶（C）轉變為尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶保持不變。這一步，操作繁瑣，費錢費力，且極端的反應條件可能降解DNA。

直接檢測甲基化也不是不行，目前的方法有薄層層析、HPLC、質譜等。但是還沒有一種高通量方法，既能測定核酸序列，又能確定甲基化狀態。如今，美國Pacific Biosciences公司做到了。他們利用獨有的單分子實時（SMRT）測序技術，直接測定了DNA的甲基化。文章發表在近期的《Nature Methods》在線版上。

SMRT技術采用的是對DNA聚合酶的工作狀態進行實時監測的方法。DNA聚合酶催化熒光標記的核苷酸摻入到互補的核酸鏈中。核苷酸的摻入被檢測成熒光脈沖，依據其顏色鑒定出核苷酸。當聚合酶切斷連接在核苷酸末端的熒光基團時，脈沖終止。SMRT測序的一般合成速率為每秒1-3個堿基。

熒光脈沖的到達時間和持續時間產生了關于聚合酶動力學的信息，從而允許直接檢測DNA模板鏈中的修飾核苷酸，包括N6-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶和5-羥甲基胞嘧啶。聚合酶動力學的測定是SMRT測序的內在組成，不會對DNA一級序列的測定有任何不良影響。各種修飾對聚合酶動力學的影響不一，從而能夠將它們區分開。

研究人員使用這些動力學特征，鑒定出基因組樣品中的腺嘌呤甲基化，并發現再結合circular consensus sequencing，他們能夠在單堿基分辨率上鑒定出表觀遺傳學修飾（mA、mC和hmC）。研究人員還預計，其它的表觀遺傳學修飾，以及各種形式的DNA傷害，也能用這種方法檢測。

不過，對于mC和hmC，可能還需要加強動力學靈敏度。這些改進可能來自優化的緩沖液條件，聚合酶突變和算法。研究人員認為，這種方法還有望測定高度重復的基因組區域的甲基化模式。

Pacific Biosciences的測序儀將在今年上市，目前該公司已經挑選了北美10個研究機構，作為第一批試用者，其中包括貝勒醫學院、Broad研究院、冷泉港實驗室和斯坦福大學等。該公司計劃于今年晚些時候在歐洲和亞洲開展早期試用計劃。（生物通 余亮）

原文摘要：

Direct detection of DNA methylation during single-molecule, real-time sequencing

Nature Methods Published online: 9 May 2010 | doi:10.1038/nmeth.1459