序

第三代單分子測序概念一經(jīng)提出，就在全球范圍內(nèi)引起了巨大反響，被譽(yù)為“未來測序應(yīng)用的基準(zhǔn)線”。然而，幾年過去了，這一類創(chuàng)新的技術(shù)并未如預(yù)期般攻城略地得到普及，反而有點(diǎn)“出師未捷”的味道——Helicos已申請(qǐng)破產(chǎn)保護(hù)，Complete Genomics難逃被收購的命運(yùn)，Oxford Nanopore雖然呼聲很高，但宛若空中樓閣遲遲不見現(xiàn)身。唯有PacBio還在奮力前行。單分子測序技術(shù)還值得繼續(xù)關(guān)注嗎？

當(dāng)然！PacBio最新升級(jí)的商品化試劑使得用戶平均測序讀長達(dá)到了前所未有的5000bp! 堪稱測序史的又一個(gè)新里程碑！

新技術(shù)有多好？誰用誰知道。內(nèi)行看門道。生物通就幾個(gè)廣受關(guān)注的主題征詢收集了眾多聲名赫赫的PacBio用戶的心得和經(jīng)驗(yàn)之談，以用戶現(xiàn)身說法的方式，“原汁原味”為您呈上這一第三代單分子測序系統(tǒng)全球訪談紀(jì)要系列報(bào)道。這些實(shí)力雄厚的用戶，個(gè)個(gè)成績斐然，堪稱權(quán)威，手頭擁有的各種最新型號(hào)第一代第二代測序儀可以排成行，絕對(duì)經(jīng)驗(yàn)豐富，目光犀利，他們的寶貴心得，不可錯(cuò)過！ 

   

發(fā)明人 Stephen Turner                發(fā)明人 Jonas Korlach

主題一：PacBio單分子實(shí)時(shí)測序技術(shù)存在的價(jià)值

• Broad研究院把PacBio RS系統(tǒng)作為基因分型驗(yàn)證的首選工具

Mauricio Carneiro：

Broad研究院之前在系統(tǒng)誤差糾錯(cuò)過程中吃了很多虧，二代測序數(shù)據(jù)尤其容易在高GC和同聚物的區(qū)域出現(xiàn)層出不窮的錯(cuò)誤，而這些錯(cuò)誤對(duì)付起來非常棘手，我們無法簡單地通過數(shù)學(xué)模型來解讀。
 
“而隨機(jī)誤差就完全不是一回事，任何儀器如果只有隨機(jī)誤差，那反而顯得太棒了、太完美了，因?yàn)槎鄿y幾次或者提高覆蓋度就可以把隨機(jī)錯(cuò)誤稀釋掉。所以當(dāng)其他人被PacBio的原始高錯(cuò)誤率嚇退的時(shí)候，我反而毫無顧慮。”
 
目前研究人員對(duì)于突變數(shù)據(jù)的驗(yàn)證一般采用Sequenom質(zhì)譜、Sanger測序法。雖然這兩種方法的準(zhǔn)確性很高，但是Sequenom方法對(duì)未知位點(diǎn)突變無法進(jìn)行檢測，且很多分析仍然需要借助人工方法，而Sanger測序法通量低、花費(fèi)大且同樣存在人工誤差的問題。此外采用多種測序平臺(tái)進(jìn)行交叉驗(yàn)證也大大降低了效率，且產(chǎn)生新的突變類型導(dǎo)致更加復(fù)雜的分析。所以，最好是利用已有的測序平臺(tái)直接產(chǎn)生高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)，最大程度避免其他方法的交叉驗(yàn)證。“基于這些考慮，我們對(duì)PacBio給予了厚望。隨著項(xiàng)目進(jìn)展，現(xiàn)在它已經(jīng)成為我們的標(biāo)準(zhǔn)工具。”

我們從千人基因組計(jì)劃產(chǎn)生的SNP數(shù)據(jù)中挑選了98個(gè)已經(jīng)用其他方法驗(yàn)證過的難測SNP位點(diǎn)，盡管之前沒人知道為什么這些位點(diǎn)那么難測，“但事實(shí)就是，這些位點(diǎn)在一般其他的測序儀上測的話總是一如既往地出錯(cuò)”，所以這些位點(diǎn)就成了測試測序儀性能的標(biāo)準(zhǔn)。我們分別利用PacBio平臺(tái)和Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PacBio數(shù)據(jù)有著更好的準(zhǔn)確性和假陽性檢出率，相對(duì)而言是一種更為有效的驗(yàn)證工具。

在認(rèn)為PacBio比MiSeq有效之前，我們發(fā)現(xiàn)PacBio數(shù)據(jù)中存在相當(dāng)程度的參考偏好性（Reference Bias）。“這個(gè)參考偏好性后來發(fā)現(xiàn)是我們?nèi)藶閷?dǎo)致的。當(dāng)我們把PacBio數(shù)據(jù)與參考序列進(jìn)行程序比對(duì)時(shí)，因?yàn)殡S機(jī)誤差中大部分都是插入導(dǎo)致，程序糾錯(cuò)過程就特別傾向于去反轉(zhuǎn)插入誤差，這里面就可能把真實(shí)存在的SNP誤解為插入誤差給‘糾正’了，結(jié)果反而掩蓋了真實(shí)檢出的SNP。” 我們發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象后修正了的算法,最近將心得都整理了一下，發(fā)布了beta版HapltoytpeCaller作為補(bǔ)充算法，并整合到GATK基因組分析工具包中。

注：詳情請(qǐng)見參考文獻(xiàn)4、參考影像1 & 3。此外，Sanger研究院在2012年7月刊的BMC Genomics上也發(fā)表了新一代測序技術(shù)的評(píng)測文章，正好比Broad研究院的文章早一個(gè)月，根據(jù)Sanger的結(jié)果PacBio只能檢測出71%的SNP。Sanger當(dāng)時(shí)使用的試劑版本是C1（Broad用的是升級(jí)后的C2），他們?cè)诮◣鞂?shí)驗(yàn)過程和數(shù)據(jù)分析設(shè)置中也出現(xiàn)了些問題。看到Broad這篇文章發(fā)表后，雙方也有技術(shù)交流，之后Sanger研究院的Paul Coupland 8月專程到PacBio的總部Menlo Park去訪問,觀摩研討如何優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案。

• 如何正確看待錯(cuò)誤率和測序數(shù)據(jù)質(zhì)量

Michael Schatz：

開始的時(shí)候我們?cè)鴮?duì)PacBio公布的單分子測序相對(duì)的高錯(cuò)誤率也表示過擔(dān)憂，但等弄明白這個(gè)是隨機(jī)錯(cuò)誤的時(shí)候，我們便釋然了。“對(duì)于一個(gè)精通算法的信息學(xué)高手而言，隨機(jī)錯(cuò)誤里的世界完全不同于系統(tǒng)性誤差，隨機(jī)錯(cuò)誤是相對(duì)比較容易用概率算法進(jìn)行修正的，但修復(fù)系統(tǒng)性誤差就不是統(tǒng)計(jì)學(xué)能夠解決的范疇了。”我們開發(fā)的算法“將PacBio錯(cuò)誤率從15%減少為不到千分之一”，而且我們把這個(gè)算法以開放源代碼的形式發(fā)布到萬維網(wǎng)上，讓任何人都可以使用它。

“短讀長測序的優(yōu)點(diǎn)是得到高質(zhì)量的深度覆蓋，然而，它的缺陷也很明顯，比如無法對(duì)高重復(fù)區(qū)域和單倍體型或雜合子序列等這些復(fù)雜區(qū)域進(jìn)行測序。”其結(jié)果是，很多具有重要生物學(xué)功能的序列（比如某些特定基因和啟動(dòng)子區(qū)域），用基于短讀長的二代測序法只能給出大量支離破碎的片段。“短讀長局限同時(shí)還給其他諸如全轉(zhuǎn)錄組測序（包含可變剪切信息）和宏基因組測序（基于16S核糖體RNA基因測序）等項(xiàng)目中的計(jì)算解析帶來困難，甚至有時(shí)候根本無法進(jìn)展下去。”

注：詳情請(qǐng)見參考文獻(xiàn)1、參考影像5。

Tim Hunkapiller：
 
“數(shù)據(jù)質(zhì)量是個(gè)相對(duì)的概念。在我看來，PacBio產(chǎn)出的10 Kb讀長數(shù)據(jù)所包含的信息量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過Illumina產(chǎn)出的200 bp的讀長數(shù)據(jù)，況且在微生物基因組測序應(yīng)用中，PacBio明顯更能勝任，還能做堿基修飾的動(dòng)力學(xué)分析，這些都是有目共睹的。另外，從原理上來看，Illumina的讀長永遠(yuǎn)無法超越PacBio，正如它的準(zhǔn)確性也永遠(yuǎn)無法超越CE一樣。所以，懂PacBio的人總是更看重其讀長優(yōu)勢，而非拘泥于單分子測序的錯(cuò)誤率，正所謂瑕不掩瑜。”
 
“再談錯(cuò)誤率，其實(shí)這方面業(yè)內(nèi)已慢慢達(dá)成共識(shí)，Illumina產(chǎn)生的錯(cuò)誤率是系統(tǒng)誤差，而PacBio是隨機(jī)的。隨機(jī)即意味著它可以通過增加次數(shù)來抹平誤差，何況PacBio的CCS環(huán)形比對(duì)模式已經(jīng)在很大程度上可以自行糾錯(cuò)，如果不計(jì)投入，最終達(dá)到的數(shù)據(jù)質(zhì)量將超過Illumina。”

David Munroe：

“這是一個(gè)漸進(jìn)的過程，人們需要時(shí)間慢慢習(xí)慣三代測序的數(shù)據(jù)產(chǎn)出形式，以及安裝合適的軟件來分析它。”

Adam Phillippy：

“第三代測序儀正在生成一種全新類型的測序數(shù)據(jù)。過去5年或更長時(shí)間以來算法開發(fā)幾乎完全集中于高通量、高準(zhǔn)確度的短讀長數(shù)據(jù)。將軟件開發(fā)過程轉(zhuǎn)向另一個(gè)新焦點(diǎn)還需要相當(dāng)長的時(shí)間。”所以我們這個(gè)算法的誕生可以認(rèn)為是朝著這一正確方向邁出了重要的一步。
  
“從454 和 Illumina技術(shù)引入到被廣泛接受，并將Sanger測序推至小角色之前，也存在相似的兩至三年的滯后。”一旦這些障礙被克服，第三代測序技術(shù)將使研究人員能夠深入了解其他不容易用第二代測序技術(shù)研究的大型結(jié)構(gòu)變異相關(guān)的疾病，例如癌癥、自閉癥和染色體疾病等。長讀長單分子測序也可以揭示對(duì)包含在基因組中的Junk DNA的認(rèn)識(shí)，這些Junk DNA被認(rèn)為起著重要的調(diào)控作用，但由于無法正確組裝而沒有得到廣泛研究。

“我期望第二代和第三代技術(shù)將可以和平共存直至產(chǎn)生另一個(gè)巨變。”

• 擁有高質(zhì)量參考基因組和缺口修復(fù)工作的重要性

Michael Schatz：

“事實(shí)上，當(dāng)今大量的測序項(xiàng)目集中在人類基因組重測序項(xiàng)目或者其他類似研究，這些項(xiàng)目有參考基因組存在，因此使用Illumina的短讀長數(shù)據(jù)就可以完成了。但當(dāng)你手頭上沒有參考基因組，或者你正好對(duì)大片段結(jié)構(gòu)變異比較感興趣，抑或你必須要拿到一個(gè)高質(zhì)量的完整基因組圖，比如在司法鑒定場合需要獲得每個(gè)堿基的詳盡信息，那么三代長讀長數(shù)據(jù)就顯得不可或缺了。”

Lance Price：
 
我們目前遇到的最大瓶頸是，我們太需要完整的基因圖譜了，在家畜流行病領(lǐng)域尤為如此。“我們需要一個(gè)足夠強(qiáng)大、數(shù)據(jù)足夠豐富的參考基因組系列，最好是全封閉的基因圖譜，任何的缺失都可能讓我們丟掉關(guān)鍵的信息，這樣我們才能把現(xiàn)有工作獲得的草圖和參考序列進(jìn)行精細(xì)的對(duì)比分析，才能真正揭示家畜流行病的歷史淵源。”現(xiàn)在興起的第三代單分子測序?qū)ξ覀兌�言的確是一個(gè)契機(jī)，依靠長度長數(shù)據(jù)去填充或矯正早期的參考序列，同時(shí)也能完善我們現(xiàn)有的家畜個(gè)體基因組草圖。“聽上去很美好，這樣我們的工作才有意義，家畜流行病進(jìn)化史才更真實(shí)，更容易預(yù)測未來的發(fā)展軌跡。”

Dave Rasko：
 
“高質(zhì)量的參考基因組信息無疑是重要的，它能真正告訴你什么是真什么是假。”15-20年間我們?cè)谶@方面做了很多努力，測了大量的微生物基因組，“然而真正我們能稱之高質(zhì)量的并不多，而且可以說很少”。我們過去一味強(qiáng)調(diào)單次數(shù)據(jù)質(zhì)量，而二代測序確實(shí)可以提供短讀長方面的高質(zhì)量數(shù)據(jù)質(zhì)量，但這跟最終的高質(zhì)量參考基因組圖譜是兩個(gè)概念。“再好的數(shù)據(jù)質(zhì)量，如果換來的只是Scaffold，遺留大量Gap的話，我們至少現(xiàn)在認(rèn)為并不可取，所以我們現(xiàn)在開始傾向于犧牲一部分的數(shù)據(jù)質(zhì)量，去換取高質(zhì)量的參考圖譜，這樣在今后的工作，這些高質(zhì)量的圖譜可以幫我們以高通量的模式對(duì)單次測序結(jié)果去偽存真。”

“我們現(xiàn)在就是把二代和三代測序結(jié)合起來用，用Illumina數(shù)據(jù)提供高覆蓋度，用PacBio數(shù)據(jù)提供長讀長，然后混合拼接，基本上就可以拿到越來越符合我們要求的高質(zhì)量圖譜了。”

Richard Gibbs：

就目前的數(shù)據(jù)來說，各種已測序物種的基因組中缺口所占的百分比從1.3%至13%不等，這是由于NGS生成的片段過短，無法跨越高度重復(fù)和高GC含量的基因組區(qū)域。“大量的基因組空白區(qū)域中可能存在重要的生物學(xué)信息，如果無法補(bǔ)齊Gap，不僅不能獲得完整的基因圖譜，還會(huì)給后續(xù)的關(guān)鍵信息解讀造成很大的困難。”目前人們主要使用步進(jìn)PCR結(jié)合Sanger測序或者Illumina/454 Pair-end測序數(shù)據(jù)來填充空白區(qū)域，但是這些方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力、成本高、填充效率低，無法從根本上解決問題。

Adam English：

我們團(tuán)隊(duì)另辟蹊徑，利用PacBio單分子測序和長讀長數(shù)據(jù)對(duì)模式生物的基因組草圖進(jìn)行升級(jí)。“我們的目標(biāo)是準(zhǔn)確、自動(dòng)化、快速且可重復(fù)的進(jìn)行基因組升級(jí)。”此外，我們還專門開發(fā)了高度自動(dòng)化的工具PBJelly，能夠?qū)�PacBio長片段與基因組草圖進(jìn)行比對(duì)，填補(bǔ)或減少草圖中的缺口，從而完善基因組草圖。

“目前我們對(duì)兩個(gè)果蠅種、虎皮鸚鵡、白眉猴的基因草圖組進(jìn)行了升級(jí)，測序深度從4X到24X不等，其中果蠅基因組Gap數(shù)減少了15倍，虎皮鸚鵡和白眉猴的基因組Gap數(shù)減少了1.3至2.8倍，且這些基因組的Gap大小也減少了3-6倍。”提高測序深度還有進(jìn)一步提高Gap填補(bǔ)效率的空間。

注：詳情請(qǐng)見參考文獻(xiàn)2、參考影像2。

• PacBio在揭示德國大腸桿菌疫情爆發(fā)菌株中的突出作用

Eric Schadt：

“從樣本制備到測序結(jié)果，平均只需8小時(shí)，平均讀長為2,900 bp，而最長的讀長達(dá)到7,800 bp，再結(jié)合CCS環(huán)形一致序列測序模式，實(shí)現(xiàn)了非常高的單分子準(zhǔn)確性，最后完整拼接。在此項(xiàng)目證實(shí)了PacBio在復(fù)雜微生物病原體的de novo測序的能力，以及在多個(gè)基因組快速測序上的威力，這些有助于闡明病原體微生物的進(jìn)化史。”

注: 詳情請(qǐng)見參考文獻(xiàn)3、參考影像4。

Karen Krogfelt：

在PacBio之前，還沒有哪一種測序方法可以在8個(gè)小時(shí)之內(nèi)完成一個(gè)基因組測序，后續(xù)的拼接與分析也非常迅速，從拿到樣本到文章發(fā)表只用了2個(gè)月時(shí)間，令業(yè)內(nèi)為之震驚。我不是否認(rèn)其他測序方法無法完成這項(xiàng)工作，只是那些方法花費(fèi)大、耗時(shí)長，不太適合作為傳染病爆發(fā)時(shí)對(duì)病原體的快速監(jiān)測和分析。

“PacBio不僅反應(yīng)迅速，而且提供的這些高質(zhì)量的數(shù)據(jù)將更便利科學(xué)家去揭示致病菌株的其他深層次信息。這種病原體的全面進(jìn)化分析將協(xié)助鑒定出抗生素耐藥性的標(biāo)志物，以便在未來出現(xiàn)相關(guān)菌株導(dǎo)致疾病暴發(fā)時(shí)及時(shí)應(yīng)對(duì)。”

Dave Rasko：

“多菌株測序數(shù)據(jù)分析顯著深化了人們對(duì)這個(gè)新型致死大腸桿菌菌株的科學(xué)認(rèn)識(shí)，并掀開了深入探索其進(jìn)化起源和致病性起源的新篇章。”

“這一結(jié)果是迄今為止提供的最為完整的爆發(fā)菌株的基因組譜圖，同時(shí)也強(qiáng)調(diào)了DNA測序?qū)σ咔檠芯康耐怀鲐暙I(xiàn)，唯有一套完整的測序方案才能深刻認(rèn)識(shí)細(xì)菌基因組可塑性的程度，從而知道它以何種方式促成新型病原體的出現(xiàn)。”

• PacBio RS系統(tǒng)全球用戶總評(píng)

Michael Hunkapiller：
 
“自2011年4月至今，全球已擁有70多套PacBio RS系統(tǒng)正式進(jìn)入客戶端運(yùn)行。”

Nick Bergman：

“PacBio RS系統(tǒng)是NBACC測序項(xiàng)目的重大擴(kuò)展，其長讀長和通量靈活性為我們鑒定微生物病原體提供了很多新的選擇。我們非常激動(dòng)能在多個(gè)應(yīng)用中率先使用它。”

Harold Swerdlow：

“過去我常常建議人們買什么樣的測序儀合適，但現(xiàn)在我也開始糾結(jié)了。這完全決定于你想拿它干什么——市面上的測序儀都各有千秋，各有獨(dú)門絕技。”

對(duì)于大的測序中心而言，只要新的測序技術(shù)出來，我們的反應(yīng)就很直截了當(dāng)，那就是“買下來趕緊試”。“我們傾向于測試絕大部分上市的測序儀，只要有理由相信新參數(shù)能帶來一定程度的技術(shù)革新。”

“為了維持基因組學(xué)的前沿地位，我們探索基因組測序中的新機(jī)會(huì)。我們計(jì)劃使用PacBio來改善病原體的de novo拼接，并提高一些物種的序列信息覆蓋度，在未來，我們將通過甲基化位點(diǎn)的直接檢測來探索表觀遺傳學(xué)。”

Eddy Rubin：

“我們的重點(diǎn)之一是de novo測序，用de novo測序的方法解析我們之前不了解的基因組，如宏基因組、真菌、植物等，長讀長將是一個(gè)極大優(yōu)勢，因此PacBio對(duì)我們的確有幫助。”

“我們能夠用Illumina更經(jīng)濟(jì)地開展多個(gè)應(yīng)用，在多個(gè)長讀長應(yīng)用中我們將使用PacBio平臺(tái)，在這之前我們使用羅氏454的測序技術(shù)，但現(xiàn)在我們希望能夠用PacBio做之前454所做的許多事情。”

W. Richard McCombie：

“我們非常看重PacBio長讀長在多個(gè)項(xiàng)目中的價(jià)值，這些項(xiàng)目包括了解人類基因組中的結(jié)構(gòu)變異，以及植物基因組的de novo測序。”

Brewster Kingham：
 
“2011年9月我們投入安裝了PacBio RS系統(tǒng)，我想，我們這的應(yīng)該是全球第25臺(tái)吧。我們用PacBio測病毒、細(xì)菌以及真核樣品，我們也有一些基因組測序項(xiàng)目，比如用于海洋微生物的宏基因組。”
 
PacBio最適合的場合，主要在de novo測序或配合二代數(shù)據(jù)組裝、堿基修飾直接識(shí)別、以及應(yīng)用于靶向重測序中發(fā)現(xiàn)稀有突變、SNP、結(jié)構(gòu)性變異（大片段插入或缺失）、單倍體型等等。“當(dāng)然，我們的興趣主要在宏基因組分析，單分子測序無需擴(kuò)增，理論上就可以把環(huán)境中的任何微生物種群準(zhǔn)確無誤地鑒定出來。目前而言我們還是先從擴(kuò)增開始，但我們正想往無需擴(kuò)增的道路邁進(jìn)。”
 
“C1和C2試劑我們都嘗試過，C2太棒了，我敢說，和C1相比簡直是‘白天與黑夜’的區(qū)別。”以前可能還有人對(duì)PacBio或者第三代測序持懷疑態(tài)度，C2的推出，可以在一定程度上逆轉(zhuǎn)這樣的邏輯。“我們用C2獲得了4000 bp的平均讀長，每個(gè)SMRT Cell的數(shù)據(jù)產(chǎn)出達(dá)到300 M，這比PacBio的官方數(shù)據(jù)還要好，我們沒理由不滿意。就連樣品起始量也有所改進(jìn)，比如我們現(xiàn)在可以嘗試從500 ng做起。”
 
“錯(cuò)誤率高？！我并不這么認(rèn)為。起碼我們的平均讀長達(dá)到了4000 bp，以16S 核糖體擴(kuò)增子測序?yàn)槔�，我們主要通過CCS環(huán)形比對(duì)測序模式，基因長度在600-700 bp，可以在單分子測序狀態(tài)下實(shí)現(xiàn)4-6個(gè)Reads。覆蓋度一提高，單分子的正確率就大大提高了。”還是同一個(gè)例子，我們測試的結(jié)果是，“2X覆蓋對(duì)應(yīng)的正確率為97%，3X為98%，如果采用5X以上，正確率就可以突破99%”。
 
“人們總是很喜歡拿第三代測序數(shù)據(jù)和第二代甚至第一代進(jìn)行比較，但我認(rèn)為，這實(shí)在不公平，三個(gè)階段的數(shù)據(jù)類型完全不是一個(gè)概念。”你可以選擇在Sanger、Illuminated和PacBio之間進(jìn)行對(duì)比，甚至可以在每兆堿基多少費(fèi)用的問題上糾纏不清。但不要忘了，我們從來不否認(rèn)：Sanger法的超強(qiáng)精確性，盡管它目前是最昂貴的；Illumina是便宜，但讀長太短，準(zhǔn)確性也不比Sanger法高；PacBio可以將你引入單分子測序的境界，你的最大好處是可以獲得4000 bp的平均讀長，錯(cuò)誤率總體看是隨機(jī)的。“我只能說，任何東西都有缺陷，取決于你怎么去用好它。”
 
談到測序費(fèi)用，實(shí)際操作下來，對(duì)完成整個(gè)項(xiàng)目從測序、拼接、精細(xì)圖、甚至到完整圖，PacBio和Illumina結(jié)合起來的耗費(fèi)最節(jié)約。

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參考文獻(xiàn)

1. Hybrid error correction and de novo assembly of single-molecule sequencing reads. Koren S, Schatz MC, Walenz BP, Martin J, Howard JT, Ganapathy G, Wang Z, Rasko DA, McCombie WR, Jarvis ED, Adam M Phillippy. Nat Biotechnol. 2012 Jul 1;30(7):693-700.
http://www.nature.com/nbt/journal/v30/n7/full/nbt.2280.html

2. Mind the Gap: Upgrading Genomes with Pacific Biosciences RS Long-Read Sequencing Technology. English AC, Richards S, Han Y, Wang M, Vee V, Qu J, Qin X, Muzny DM, Reid JG, Worley KC, Gibbs RA. PLoS One. 2012;7(11):e47768.
http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0047768)

3. Origins of the E. coli strain causing an outbreak of hemolytic-uremic syndrome in Germany. Rasko DA, Webster DR, Sahl JW, Bashir A, Boisen N, Scheutz F, Paxinos EE, Sebra R, Chin CS, Iliopoulos D, Klammer A, Peluso P, Lee L, Kislyuk AO, Bullard J, Kasarskis A, Wang S, Eid J, Rank D, Redman JC, Steyert SR, Frimodt-M?ller J, Struve C, Petersen AM, Krogfelt KA, Nataro JP, Schadt EE, Waldor MK. N Engl J Med. 2011 Aug 25;365(8):709-17.
http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa1106920

4. Pacific biosciences sequencing technology for genotyping and variation discovery in human data. Carneiro MO, Russ C, Ross MG, Gabriel SB, Nusbaum C, DePristo MA. BMC Genomics. 2012 Aug 5;13:375.
http://www.biomedcentral.com/1471-2164/13/375

參考影像
1. PacBio AGBT 2012 Carneiro
2. PacBio AGBT 2012 English
3. PacBio AGBT 2012 Testimonial Carneiro
4. Webinar: The Role of Adenine Methylation in Determining the Pathogenicity of a Bacteria, Eric Schadt (Mt. Sinai School of Medicine)
5. Webinar: Mike Schatz (CSHL) - Error Correction and De Novo Assembly of Complex Genomes.

主題二：PacBio RS系統(tǒng)在de novo測序中的優(yōu)勢