Pacific Biosciences的用戶現(xiàn)在可以使用公司最新發(fā)布的堿基修飾分析方法在微生物和致病菌中（如大腸桿菌Escherichia coli和沙門氏菌Salmonella）研究甲基化及其它表觀遺傳學(xué)事件。

PacBio系統(tǒng)的獨(dú)特之處在于，不需要進(jìn)行甲基化測序或重亞硫酸鹽測序等額外實(shí)驗(yàn)步驟，就能夠直接進(jìn)行表觀遺傳學(xué)分析。PacBio儀器能通過聚合酶動(dòng)力學(xué)分析直接檢測堿基修飾。如果序列中存在堿基修飾（如甲基化和羥甲基化），PacBio系統(tǒng)的聚合酶在加入核苷酸時(shí)就會(huì)出現(xiàn)可檢出的停頓，而這種動(dòng)力學(xué)信號就能揭示堿基修飾的存在。

日前，PacBio公司發(fā)布了新軟件，能在測序數(shù)據(jù)中標(biāo)出堿基修飾事件。PacBio RS測序系統(tǒng)和C2化學(xué)試劑的用戶能免費(fèi)下載這一軟件。用戶也可以選擇使用自己的生物信息學(xué)軟件來處理測序數(shù)據(jù)，對上述聚合酶停頓事件進(jìn)行分析。

雖然PacBio這一軟件的算法目前還不能區(qū)分不同類型的堿基修飾，但是日后將會(huì)在該軟件中整合不同堿基修飾的相關(guān)信息，以區(qū)分鑒定各種修飾類型。

在PacBio的系統(tǒng)中，每種堿基修飾事件都會(huì)使聚合酶的“停頓模式” 產(chǎn)生微小差異，對其進(jìn)一步分析就能確定修飾的類型。目前，PacBio為細(xì)菌甲基化組研究提供了一個(gè)檢測工具，研究人員能通過基因組甲基化模式來確定甲基轉(zhuǎn)移酶的特異性，從而分析細(xì)菌的甲基化組。并且還為不同的堿基修飾推薦了典型的次級峰值，來幫助研究者精確識(shí)別堿基修飾。比如如何使用該軟件在細(xì)菌基因組中分析6-甲基腺嘌呤和4-甲基胞嘧啶。

此外，PacBio的長讀序的優(yōu)勢也將推動(dòng)表觀遺產(chǎn)學(xué)的發(fā)展,這項(xiàng)技術(shù)能幫助研究者更好地理解染色體失活和印跡等表觀遺傳學(xué)事件，還能幫助研究者獲得更廣泛的表觀遺傳學(xué)圖譜從而更好地分析發(fā)育和疾病進(jìn)程。

美國能源部聯(lián)合基因組研究所（JGI）和美國農(nóng)業(yè)部（USDA）等PacBio用戶正在使用這一軟件對重要的生物能源或生物降解微生物，以及食源性疾病或感染牲畜的致病菌進(jìn)行堿基修飾檢測。

眾多文獻(xiàn)也證明甲基化在微生物生長的基本功能中扮演著重要角色，也有證據(jù)顯示甲基化也能影響微生物的致病力，例如能引發(fā)直接影響致病菌感染能力的疾病變化，而且甲基化類型可能與病菌在人體內(nèi)的適應(yīng)性和毒力有關(guān)。

有研究小組利用PacBio系統(tǒng)對引發(fā)2007年比利時(shí)的冰淇淋大腸桿菌疫情和2010年美國亞利桑那州的生菜大腸桿菌疫情的大腸桿菌O145分離株的6個(gè)E. coli基因組進(jìn)行了測序。研究小組利用PacBio的長讀序進(jìn)行基因組裝配時(shí)將一個(gè)分離株中將Illumina 和454聯(lián)合測序生成的contigs重疊群數(shù)量從353個(gè)減少到了8個(gè)。且該研究團(tuán)隊(duì)通過檢測基因組的堿基修飾，在引發(fā)美國亞利桑那州疫情的菌株中發(fā)現(xiàn)了獨(dú)特的甲基轉(zhuǎn)移酶。而PacBio測序團(tuán)隊(duì)也曾在去年夏季德國大腸桿菌疫情菌株中發(fā)現(xiàn)相同的甲基轉(zhuǎn)移酶。

引發(fā)去年夏季德國疫情的O104:H4菌株是一種腸聚集性大腸桿菌，通過整合噬菌體基因組獲得了產(chǎn)志賀氏毒素的能力。PacBio團(tuán)隊(duì)在大腸桿菌整合的噬菌體基因組中發(fā)現(xiàn)了這種甲基轉(zhuǎn)移酶，另一個(gè)團(tuán)隊(duì)在美國亞利桑那州疫情分離株中發(fā)現(xiàn)了同樣的甲基轉(zhuǎn)移酶。這種產(chǎn)志賀氏毒素的噬菌體對于德國疫情中的大腸桿菌O104的致病能力很重要，研究人員認(rèn)為這種甲基轉(zhuǎn)移酶可能也對菌株的致病力有影響。目前已有不少證據(jù)表明甲基轉(zhuǎn)移酶能影響致病菌的致病力。該研究團(tuán)隊(duì)表示其下一步研究是對來自加利福尼亞薩利納斯山谷農(nóng)業(yè)區(qū)的6000種產(chǎn)志賀氏毒素的大腸桿菌分離株進(jìn)行PCR篩選，看它們是否也含有同樣的甲基轉(zhuǎn)移酶，會(huì)繼續(xù)應(yīng)用PacBio平臺(tái)檢測不同疫情菌株的堿基修飾。

目前擁有兩臺(tái)PacBio 儀器的美國能源部DOE聯(lián)合基因組研究所JGI也正在使用新推出的軟件進(jìn)行堿基修飾分析。研究人員表示，除了常見的5-甲基胞嘧啶，PacBio系統(tǒng)還對檢測其它堿基修飾特別有用。如在細(xì)菌中很常見的N6-甲基腺嘌呤修飾，很難通過重亞硫酸鹽測序等化學(xué)轉(zhuǎn)化方法檢測到，該研究所正在使用PacBio對其測序的絕大多數(shù)細(xì)菌基因組進(jìn)行N6-甲基腺嘌呤檢測。

美國NEB公司也在和PacBio合作對限制性內(nèi)切酶的N6-甲基腺嘌呤和4-甲基胞嘧啶以及相關(guān)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行檢測。他們利用PacBio進(jìn)行測序和剪輯分析，先在只有兩到三個(gè)限制性修飾系統(tǒng)的細(xì)菌基因組中檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方案的可行性，通過對全基因組測序和甲基化位點(diǎn)檢測，研究人員可以找到甲基化酶的識(shí)別位點(diǎn)。

NEB公司正在研究一類特殊的限制性內(nèi)切酶，傳統(tǒng)的方法難以確定它們的識(shí)別序列，這是因?yàn)檫@些酶隨機(jī)進(jìn)行剪切，所以確定其識(shí)別位點(diǎn)的唯一方法是直接檢測甲基化位點(diǎn)，但通常要進(jìn)行幾個(gè)月的實(shí)驗(yàn)才能得到一個(gè)清晰的識(shí)別位點(diǎn)。NEB公司采用了PacBio的系統(tǒng)來完成這項(xiàng)工作，盡管5-甲基胞嘧啶引發(fā)的PacBio信號并不像N6-甲基腺嘌呤或4-甲基胞嘧啶那么強(qiáng)，但他們?nèi)蚤_發(fā)出了有效的檢測方案。到目前為止的甲基化研究都是與PacBio合作完成的，良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果讓NEB公司決定準(zhǔn)備購買一臺(tái)PacBio單分子測序儀器。

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