生物通報道：如果說DNA是建筑師的設計圖，那么RNA就是決定在一個細胞中真正要建造什么的承包商。通過在RNA水平進行基因表達分析，能夠揭示為什么遺傳學上相似的兩個物種，例如黑猩猩和人類存在如此大的差別。在一個個體中，基因表達決定了一個小拇指是在哪里形成的，與大拇指相對應。很多年來，在已經完成基因組測序的模式生物中，生物學家們已經能夠評估其RNA水平，而那些不關注模式生物的研究者們還被蒙在鼓里。

研究非模式生物的生物學家們不是去追問“它們基因組中哪個基因在一個特定的時間或者在響應特定的環境變化時表達？”，而是被迫去尋找已經在模式動物中被鑒定的基因。例如，一位蜈蚣研究者只能確定無疑地回答“是否多腿動物在其觸角生長時激活與果蠅（D. melanogaster）相同的基因？”。

隨著高通量的新一代RNA測序（也稱為RNA-seq）技術的出現，這個障礙已經被克服。通過建立一個轉錄組（Transcriptome）——其包含生物體在所有組織和主要生活期所產生的所有RNA分子，這項技術允許動物學家們經濟、有效地分析基因組沒有被測序的生物中的基因活性。在RNA準備過程中，RNA被打碎成小片段，每個被測定片段就像一片拼圖，組成了完整圖像的轉錄組。

使得轉錄組學對于研究非模式生物的研究者們產生如此大的吸引力的是，它們的構建成本比基因組更低。更重要的是，當工作被正確完成時，產生的結果可能會比測定一個基因組更加可靠，因為一些動物具有龐大的基因組，那是幾乎不可能被精確組裝的。

在過去，研究者們局限于研究“大約一千萬中個物種中的20個”，美國布朗大學的進化生物學家Casey Dunn說，“現在我們能夠在某種程度上了解以前不能了解的各種各樣生物的特性。”但是，像任何新的強大工具一樣，轉錄組學也帶來了誤用和曲解。“對于一個動物學家來說，這真的是一個令人興奮的階段，”，Dunn說，“但是，它仍然像擴荒之前的美國西部一樣有待我們探索。”科學家與專家就如何構建信息最豐富的轉錄組展開討論，尋找如何使實驗更有意義的技巧。

開始構建

以新鮮為目標
當開始做RNA實驗時，新鮮組織是最好的。如果樣本必須被保存，將其快速凍結在液氮中，或者迅速放置于含RNA提取緩沖液（例如Invitrogen的RNA純化試劑盒）的EP管中。或者，一些研究者將組織保存在穩定劑RNAlater（包括Qiagen和Invitrogen的很多供應商都有銷售）中，保存在—80℃。但是沒有哪種試劑盒能夠彌補RNA的大量損失，因為RNA比DNA更加容易降解。
“我曾經在許多研究中看到，人們說他們在室溫條件下將組織寄送給合作者，這意味著很有可能他們的工作是以一種透光不均勻樣本為基礎，”Dunn說。“如果你正遇見轉錄組構建的所有麻煩，從好的樣本材料開始是非常值得的。”

早期設置對照
RNA純化的商品化試劑盒為如何將一份RNA樣本轉換成能夠被測序的cDNA提供了一步一步的用法說明。在這個最初的階段，增加一個對照樣本是不可缺少的。利用貫穿實驗過程中的這個對照，以便于測序結束后檢查污染性序列。

質量的檢測
瑞典斯德哥爾摩大學的進化生物學家Christopher Wheat在 RNA純化后，采用生物分析儀（來自美國加利福尼亞州圣克拉拉的安捷倫科技公司的2100 Bioanalyzer）檢測了每個樣本的質量。他尋找超過500~2000個堿基范圍的片段大小的正態分布，這能表明RNA沒有降解成低質量的小片段。“你不想看到的是100bp周圍的一個峰值，因為這表示降解RNA的一個積累，”他說。

整合在一起

得到更多的序列
為了產生一個轉錄組，研究者將成千上萬的RNA序列組裝成重疊的連續片段——稱為contigs，以正確的方向排列。第一步是收集提取RNA的序列。RNA-seq兩種常見的下一代測序平臺是Illumina和Roche 454。當前，很多生物學家傾向于使用Illumina進行轉錄組組裝，因為每一美元它能產生更多的序列，像組裝一個包含不同版本各種圖書的、藏書豐富的圖書館一樣，你想要在轉錄組中得到盡可能多的RNAs。然而，很多片段來自高度表達的所謂管家基因，這些基因指導新陳代謝和其它基礎生命持續過程，所以為了捕獲在更低水平表達的序列，你需要很多的讀長（reads）。“你得到的讀長中，有一半會碰上50個管家基因，”Wheat解釋說。因此，如果你收集到一百萬個序列，你會更加可能重新獲得在其它500000個基因中不明顯的基因。

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決定什么時候停止
當哈佛大學的進化發育遺傳學家Cassandra Extavour構建一種海邊很常見的甲殼動物——片腳類動物明鉤蝦（Parhyale hawaiensis）的轉錄組時，她盡可能積累了足夠多的序列。什么時候才是足夠？Extavour通過尋找一個飽和點，回答了這個問題。在她分析了一百萬個讀長后，如果單一序列繼續大量出現，她將測定其它一百萬個。“理想的是你想要盡可能得到所有來自每個階段和每個組織中的RNA，”她說，“記住，這就是你的代理基因組。”

估計軟件大小
大多數研究者一致認為，你不應依賴于基因組-組裝軟件來構建轉錄組，但是除了這個規則之外，沒有任何其它一種方式，而且軟件也經常發生變化。就在現在，很多研究者使用一個由美國布羅德研究所和耶路撒冷希伯來大學開發的、叫做Trinity的免費程序。Trinity利用一個三步過程組裝轉錄組，包括構造來自片段的全長轉錄本，根據相似性分組這些轉錄本，然后將它們分成結構上相似但不相同的平行同源基因。對于需要被組裝的每一百萬的讀長來說，Trinity需要大約1G的內存。另外一個常用的（免費的）組裝軟件是Velvet/Oases。Velvet是一個基因組組裝程序，但是當它與Oases相結合時，程序就能夠處理RNA-seq數據，過濾掉降解片段，重建屬于基因的轉錄本。

簡化流程
在利用Trinity這樣的軟件組裝你的轉錄組之前和之后，對你的數據進行加工，能夠提高效率。例如，Agalma是由Dunn實驗室開發的一個免費的流水線程序，其獲取準備組裝的數據，通過不同的分析步驟隊對數據進行自動分析。在這個程序利用Trinity組裝轉錄組之前，其通過剔除低質量的序列對數據進行清理，也將易于大量表達的核糖體RNA剔除掉。在噪音片段剔除后，Trinity運行的更快，也只需要很少的電腦內存。一旦轉錄組被構建，研究者想要利用新數據構建一個進化樹，Agalma也能夠進行這些處理。

確保你獲得高質量的序列
Wheat建議研究者，在轉錄組被構建后，采用BLAST評估其質量。你輸入的contig序列的長度應該近似等于相應的基因序列或者來自近緣種的contig。抽查其它不同的contigs。

從你的轉錄組中獲得最大信息

一旦轉錄組被組裝完成，短的RNA讀長能夠被定位在上面，這些短RNA讀長來自從蜈蚣建立它們觸角的RNA到跳躍蛙類中發現的基因的實驗。這里，各種各樣開放獲取的RNA-seq組裝軟件能夠幫助完成任務。常用的選擇包括Bowtie和Cufflinks，這兩種都可以免費下載。大多數RNA-seq組裝軟件也能估算轉錄本的相對豐度，這對于比較基因表達水平的實驗非常有用。

非常規程序的出現
許多現有的程序，例如Bowtie，由想要將RNA-seq數據中收集到的短RNA片段匹配到一個基因組而非轉錄組的研究者們開發，這也產生了一些問題。Extavour說，當她在其片腳類甲殼動物的研究中使用這些程序時，發現其三分之一的RNA-seq數據與她以前得到的片腳類動物轉錄組沒有匹配。她沒有舍棄這些數據，而是請她實驗室的生物信息學技術人員開發出一個新的組裝軟件。利用這個軟件，團隊發現了90%的RNA-seq讀長。“相比較現成的程序，我們自己開發的程序更好的完成了任務，”Extavour說。（她的技術人員，Victor Zeng，已經開始創建了自己的公司，為處理大片段數據的生物學家提供生物信息學分析。）

做同類型的比較
一個可怕的錯誤是，比較兩個物種之間的基因表達水平，或者兩個不同基因的表達水平。這樣的一個實驗的問題是，一些基因和一些生物體更容易被測序，什么看起來像一個明顯的生物學差異是這項技術的一個真正的神器。“可能在一些年之后，我們將理解測序偏差，”Dunn說，“但是現在我們不能。”記住：相同的基因，相同的物種。

面對現實
避免在非常低水平表達的基因之間的比較。即使你設法捕獲你的轉錄組中的稀有基因，它們的稀缺性將很難定量評估。

首先設置標準
當研究一個基因的表達水平時，Extavour建議研究者——如果可能的話——利用已發表的研究來決定，一個差異在實驗開始之前有多少的意義。而大多數模式生物在經過多年分析后，已經有基準標準，這項基準可能不會應用到未被研究的生物中，所以你必須找到你自己的。“考慮到你會預先對什么滿意，”她說。“一個5倍的差異是否足夠？為什么？”。例如，如果以前的調查研究發現，阻塞樹蛙皮膚斑點的一個基因的表達并不會改變斑點模式，直到僅有20%的表達蛋白保留，在基因表達中的2倍差異，將會太低以至于不具有信息性，但是一個10倍的差異能夠做到。

復制，復制，還是復制
不要僅僅一次將一個樣本與另外一個進行比較，要重復進行。例如，在2011年，Dunn和他的合作者評估了在一種與水母近緣的獨特海洋動物——管水母目動物不同組織中的基因表達差異。特別的是，為了重復三次實驗，他們采集了專門喂養的管水母動物的部分樣本，和從三個不同管水母中采集了幫助它們游泳的部分樣本（PLOS ONE 6: e22953, 2011）。“想象這些實驗就像選舉投票一樣：僅僅調查小團體的人群，可能無法揭示整個群體是如何感受的，所以你需要投票給若干個小團體，”Dunn解釋道。（生物通：王英）