生物通報道 在過去的一年里，一組稱作為CRISPR-Cas RNA引導性核酸酶（RNA-guided nucleases，RGNs）的合成蛋白被用作為基因編輯工具，讓科學團體陷入極大的興奮。利用這一某些細菌用以對抗病毒和其他病原體的方法，CRISPR-Cas RGNs可在特異位點切斷DNA鏈，由此插入新的遺傳物質。

然而，近日來自麻省總醫院（MGH）的研究人員發現了使用CRISPR-Cas RGNs一個重要的局限：會在預期靶點以外的位點上生成多余的DNA突變。這項研究在線發表在6月23日的《自然生物技術》（Nature Biotechnology）雜志上。

論文的共同資深作者、麻省總醫院病理系研究副主任J. Keith Joung博士說：“我們發現，在人類細胞中表達CRISPR-Cas RGNs可產生脫靶效應。相比于其他的基因組編輯技術，RGNs仍然具有巨大的優勢，但這些研究發現將我們的研究焦點放到了提高它們的精確度上。”

CRISPR-Cas RGNs是由一種叫做Cas 9的DNA切割酶，與一段與靶DNA片段匹配的20個核苷酸長度的短RNA片段構成，它模擬了某些細菌的原始免疫系統。當這些微生物受到病毒或其他生物體的感染時，它們會拷貝入侵者的一段遺傳密碼，將它插入到自身的DNA中，并傳遞給細菌后代。如果在未來遇到相同的病原體，細菌的Cas9在與拷貝DNA片段匹配的RNA序列的引導下，通過在靶位點切割病原體的DNA而滅活它。

大約在一年前，科學家們報告稱首次利用重編程的CRISPR-Cas RGNs，靶向并切割了特異的DNA位點。自那時起，包括Joung研究小組在內的數個研究團體，都成功利用CRISPR-Cas RGNs在果蠅、斑馬魚、小鼠和人類細胞（包括多能干細胞）中實現了基因組改造。該技術依靠一段短的RNA片段，使得CRISPR-Cas RGNs相比于鋅指核酸酶（zinc finger nucleases,ZFNs）和轉錄激活因子樣效應.物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)等其他的基因編輯工具更容易使用，并且通過重編程RGNs可以同時導入幾種遺傳改變。

然而，一直以來都基本無人探討CRISPR-Cas RGNs可能引起額外的不必要遺傳改變的可能性，于是Joung研究小組開始著手調查在表達CRISPR-Cas RGNs的人類細胞中“脫靶”基因的發生情況。由于引導RNA片段和靶DNA之間的相互作用僅僅依靠于20個核苷酸，他們推測RNA有可能會識別與靶DNA存在幾個核苷酸差異的DNA片段。

盡管以往的研究發現，單核苷酸錯配可以阻止某些CRISPR-Cas RGNs起作用，麻省總醫院研究小組在人類細胞系實驗中發現了多個例子，證實 5個核苷酸的錯配不會妨礙切割一段脫靶DNA片段。他們還發現，脫靶位點的突變率有可能和靶位點一樣高，或甚至更高，但卻未發現與ZFNs（索取鋅指核酸酶相關產品資料 ）或TALENs（索取GeneArt Precision TAL的更多信息）相關的脫靶突變。

Joung 說：“我們的研究結果并不意味著，RGNs不能成為重要的研究工具，而是表明研究人員需要在他們的實驗中考慮這些潛在的混雜效應。它們還表明，現有的RGN平臺或許不適合治療應用。我們現正致力于找到一種方法減少這些脫靶效應，以及開發一些方法鑒別人類細胞中任何給定RGN的所有潛在脫靶位點，這樣我們就可以評估開發的第二代RGN平臺是否確實在全基因組水平上更為精確。我樂觀地認為，我們可以進一步的操縱這一系統，獲得更好的特異性，因而有可能將之應用于人類疾病治療。”

（生物通：何嬙）

生物通推薦原文摘要：

High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells

Clustered, regularly interspaced, short palindromic repeat (CRISPR) RNA-guided nucleases (RGNs) have rapidly emerged as a facile and efficient platform for genome editing. Here, we use a human cell–based reporter assay to characterize off-target cleavage of CRISPR-associated (Cas)9-based RGNs. We find that single and double mismatches are tolerated to varying degrees depending on their position along the guide RNA (gRNA)-DNA interface. We also readily detected off-target alterations induced by four out of six RGNs targeted to endogenous loci in human cells by examination of partially mismatched sites. The off-target sites we identified harbored up to five mismatches and many were mutagenized with frequencies comparable to (or higher than) those observed at the intended on-target site. Our work demonstrates that RGNs can be highly active even with imperfectly matched RNA-DNA interfaces in human cells, a finding that might confound their use in research and therapeutic applications.