生物通報道：重組酶聚合酶擴增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術（由英國公司TwistDx Inc開發）。以此為基礎的TwistAmp® 核酸擴增產品，能夠在15分鐘內進行常溫下的單分子核酸檢測。該技術對硬件設備的要求很低，特別適合用于體外診斷、獸醫、食品安全、生物安全、農業等領域。

RPA的擴增引物可以說是整個反應的關鍵所在，那么怎樣才能設計好RPA引物呢？（延伸閱讀：替代PCR，RPA在HIV檢測中大展身手）

引物長度的選擇

RPA引物的長度一般為30至35個核苷酸，引物過短會嚴重影響重組酶的活性。長引物實際上是可以使用的，比如45個核苷酸的引物就曾成功用于RPA擴增。不過，長引物并不一定能提高擴增性能，反而還會增加形成二級結構的可能性，增大來自引物的噪音。為此，TwistDx公司建議大家不要設計過長的引物。

引物的序列要求

RPA引物還沒有一個確定的序列設計規則，不過這里有一些現成的經驗可供參考：

5’端的3-5個核苷酸應當避免聚鳥嘌呤，胞嘧啶在這里是有益的，能促進片段的重組。對于3’末端的3個核苷酸來說，鳥嘌呤和胞嘧啶有助于聚合酶的穩定結合，可以提升引物的擴增性能。引物中最好不要出現特殊序列，比如長串的聚嘌呤或聚嘧啶。GC含量過高（>70%）或過低（<30%）都不利于RPA擴增。此外，引物設計時應當盡量避免容易形成二級結構、引物-引物互作、發夾結構的序列，減少引物二聚體的形成。

擴增產物的長度限制

RPA可以擴增長達1.5kb的DNA產物，不過這取決于反應的條件。標準TwistAmp試劑盒針對反應速度進行了優化，目前只適合擴增不超過500bp的擴增子，對100-200bp的擴增子效果最佳。RPA擴增產物的下限主要由RPA引物所決定，通常擴增產物要超過70-80bp。

如果需要用到檢測探針，那么在設計擴增引物時應該留下足夠的空間。

引物篩選的主要流程

目前我們還不能僅根據序列判斷引物的擴增性能，因此需要對候選引物進行測試和篩選。RPA的引物篩選主要分為以下幾步：選擇靶標區域，設計候選引物，篩選候選引物，提升性能再次篩選。（更多信息參見TwistDx官網：http://www.twistdx.co.uk/）

需要注意的是，靶標區域應選擇核苷酸組成相對“平均”的模板序列。GC含量最好在40%到60%之間，不含長串的聚嘌呤或聚嘧啶，盡量不含正/反向重復和回文序列等等。靶標區域最好避開基因組中的重復元件。

生物通編輯：葉予