Western blot常用于確定生物樣本中蛋白質的相對表達量。傳統的化學發光法是一種定性或半定量的方法，因為累積發光量缺少線性和定量的重復性。隨著熒光染料技術的進步，定量范圍、靈敏度和穩定性都較ECL檢測顯著提高，Western blot檢測也因此進入了定量分析的行列，而這對樣品上樣量一致性的控制提出了更高的要求。LI-COR公司是定量Western blot領域的領頭羊，它的Odyssey雙色紅外激光成像系統具有*高的市場占有率，核心的近紅外熒光染料具有定量準確、線性范圍廣、背景低、信噪比高以及雙色檢測等優勢，作者利用這一系統開展了如下的研究。

為了精確測定樣品中蛋白質的含量，研究者常設置loading controls （LCs）用作內參。常用的LCs蛋白源于廣泛表達的“看家基因”，因為他們被認為在一系列樣品中都有一致的表達水平，其中肌動蛋白（actin）和微管蛋白（tubulin）是*常用的兩種LCs。但是，越來越多的研究指出這些蛋白質在動物和實驗模型中差異表達。此外，LCs在不同組織間或不同處理間也存在差異。因此急需新的標準化方法確保定量Western blot結果的準確性。

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作者首先檢索了已發表的芯片數據和質譜數據，發現常用的細胞骨架蛋白（actin，actinin和各種tubulin異構體）、線粒體蛋白（VDAC1和VDAC2）和細胞核蛋白（HC1）都存在差異表達。

接著作者用Odyssey的定量Western blot檢測了脊髓性肌萎縮（Spinal muscular atrophy，SMA）小鼠的脊髓組織樣本和正常樣本中β肌動蛋白和β微管蛋白的表達水平。結果見圖1，這兩個蛋白的表達量在SMA小鼠中顯著下降，分別為19.3±2%和7.3±0.5%。而這兩個樣本在總蛋白上的一致性卻非常好，差異只有1.8±0.4%。

圖1：β-肌動蛋白和β-微管蛋白的定量Western blot結果表明其在病理組織中的表達改變。A：β-肌動蛋白（42 kDa，綠色）和總蛋白（紅色）的重疊圖；B：β-微管蛋白（60 kDa，綠色）和總蛋白（紅色）的重疊圖；C：SMA小鼠和正常小鼠β-肌動蛋白和β-微管蛋白表達水平的變化，β-肌動蛋白（黑色），β-微管蛋白（灰色）。總蛋白（白色）用作對照。

證實了LCs在病變組織和正常組織間存在差異表達后，作者研究了LCs在不同正常組織間的差異表達。作者用Odyssey定量Western blot檢測了C57Bl/6小鼠的肌肉、心臟、骨骼、顱骨，脾和脂肪組織中β-肌動蛋白的表達水平（圖2 A和B）。為了確認這種變異不是由于上樣量誤差所引發，作者檢測了不同分子量范圍內的總蛋白（圖2C）。結果表明這種差異非常小，上樣的一致性非常好。不同組織間β-肌動蛋白的表達水平呈現出顯著的差異（圖2 B和D），尤其是心臟和腎臟間的差異尤為顯著，達到44 arbitrary fluorescence units (AFU)。顯然，用β-肌動蛋白去做數據均一化以及不同組織間的比較會導致巨大的偏差。

圖2：β-肌動蛋白的表達水平在不同組織間高度變化。A：組織樣本示意圖，從左至右依次為：肌肉（腓腸肌），心臟，骨（股骨），顱骨，脾和脂肪組織（性腺）。比例尺=1厘米。B：Odyssey定量Western blot結果展示β-肌動蛋白（綠色）的表達水平在肌肉，心臟，骨骼，顱骨，脾和脂肪中高度變異。總蛋白染色（紅色）疊加作為對照。C：不同分子量范圍內的總蛋白量表明上樣量控制的準確性。D.堆積條形圖顯示出β-肌動蛋白的相對變化（綠色）和總蛋白測定（紅色）。

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另外，作者還發現在非對稱組織的不同部位，LCs的表達水平也是不一致的。作者采用Odyssey定量Western blot研究了小鼠坐骨神經近端和遠端β-肌動蛋白與neurofilament-light的表達水平，結果發現這兩個蛋白質在不同區域的表達水平不一致（圖3）。同樣地，作者發現總蛋白具有很好的一致性。

圖3：肌動蛋白和NF-L在小鼠坐骨神經的不同區域表達水平不同。

理想的內參需要具有寬的線性定量范圍以滿足不同豐度蛋白的定量需要。為了評估β-肌動蛋白和β-微管蛋白在定量Western blot上的適用性，作者檢測了它們的工作線性范圍和靈敏度。檢測樣本為梯度稀釋的小鼠大腦組織勻漿液，總蛋白量為1-40 μg。結果發現β-肌動蛋白的線性范圍為1-30 μg總蛋白量（圖4 A和B）。這一定量Western blot的檢測結果與先前報道的結果有差異，先前認為2 μg的總蛋白量β-肌動蛋白的信號就會達到飽和。這一差異在于先前研究采用的是低靈敏度的ECL檢測，這一方法的定量能力不及Odyssey的近紅外熒光檢測技術。β-微管蛋白的的情況類似，只是其在大腦中的豐度更高，因此總蛋白量在8-10 μg時它的信號就達到了飽和（圖4 A和B）。這一結果同樣與先前的報道不一致，先前認為β-微管蛋白線性范圍的上限為5 μg的總蛋白量。這一差異同樣也是方法學上的差異所引起的。根據上述結果，β-微管蛋白更適于在檢測低豐度蛋白時用作內參，而β-肌動蛋白具有更寬的線性范圍。另外，相比傳統的ECL法，LICOR公司的近紅外熒光染料顯然可以提供更加寬廣的線性范圍。

*后，作者提出了用總蛋白分析（total protein analysis）進行準確可靠的上樣控制。作者用梯度稀釋的胎牛血清白蛋白（BSA）標準品評估檢測的靈敏度（圖4 E和F）。熒光信號的線性非常好，R2達到0.998。另外，從圖像可以看出，Odyssey近紅外熒光法可以減少ECL法中常見的信號飽和問題。在實際應用中，總蛋白分析（考馬斯亮藍染色）具有比肌動蛋白和微管蛋白更寬的線性范圍，1-40 μg，圖4G和H。因此，以總蛋白分析做標準化能夠很好地滿足定量Western blot的需求。

圖4：總蛋白分析具有比傳統內參蛋白（肌動蛋白和微管蛋白）更好的靈敏度和更寬的線性范圍。

原文：Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting

欲了解近紅外技術的其他應用，請參見“基于近紅外熒光檢測技術的In-Cell Western™ Assay的應用與方法學優勢” http://www.lsnkyy.cc/newsf/2012-10/2012101094727739.htm

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