了解下列章節(jié)中提出的有關(guān)免疫檢測(cè)的概念，將有助于優(yōu)化特定樣品的操作。

• 雙印跡

在Western印跡中避免非特異結(jié)合的一種新方法是由法國(guó)國(guó)家反興奮劑實(shí)驗(yàn)室的Françoise Lasne博士開(kāi)發(fā)的（Lasne，2001；Lasne，2003）。在研究重組人促紅細(xì)胞生成素（EPO）時(shí)，Lasne博士發(fā)現(xiàn)重組和天然的EPO有著不同的等電點(diǎn)（pI）。重組EPO的pI為4.42-5.11，而天然EPO的pI偏酸性，為3.92-4.42。然而，在轉(zhuǎn)印尿液樣品時(shí)，二抗的超高非特異結(jié)合（NSB）讓人難以區(qū)分重組和天然EPO。為了避免NSB，Lasne博士使用了“雙印跡”。在一抗與印跡蛋白結(jié)合后，抗體在酸性條件下被轉(zhuǎn)移到第二張Immobilon®-P膜。一抗從相應(yīng)的抗原上釋放，并通過(guò)中間體轉(zhuǎn)移到第二張（雙印跡）膜上。當(dāng)雙印跡膜與二抗雜交時(shí)，不存在其他的蛋白非特異結(jié)合，從而避免了背景問(wèn)題。

“雙印跡”也被用于轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白的檢測(cè)，是檢測(cè)低濃度的血清或尿液蛋白的有用方法。

• 檢測(cè)底物

現(xiàn)代的免疫檢測(cè)方法是基于酶連檢測(cè)，利用與酶共價(jià)結(jié)合的二抗，如辣根過(guò)氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP）。結(jié)合在二抗上的酶催化特異底物的降解，產(chǎn)生信號(hào)。通常使用三種類(lèi)型的底物：顯色、化學(xué)發(fā)光和化學(xué)熒光，以及用熒光基團(tuán)標(biāo)記的二抗來(lái)檢測(cè)。Immobilon® PVDF膜經(jīng)過(guò)檢測(cè)，可與所有市售的化學(xué)和化學(xué)發(fā)光底物兼容。

顯色檢測(cè)

顯色檢測(cè)（圖14）利用結(jié)合的酶來(lái)催化反應(yīng)，使得不溶性的有色沉淀物沉積，例如，不溶的藍(lán)色化合物通過(guò)5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（BCIP）和氮藍(lán)四唑鹽（NBT）的相互作用獲得的（Leary等，1983）。這種技術(shù)很容易開(kāi)展，不需要特殊的設(shè)備。不過(guò)，以下應(yīng)牢記：

• 顯色檢測(cè)的靈敏度通常至少比化學(xué)發(fā)光試劑低一個(gè)數(shù)量級(jí)。
• 沉淀物的產(chǎn)生可能干擾酶活并限制靈敏度。
• 沉淀物難以從膜上剝離，限制印跡再次用于其他蛋白質(zhì)的檢測(cè)。

圖14. 利用顯色底物BCIP/NBT（KPL）對(duì)人血清中的轉(zhuǎn)鐵蛋白進(jìn)行免疫檢測(cè)。從左到右，5 μL人血清稀釋物1:1,000、1:5,000、1:25,000、1:125,000。電轉(zhuǎn)的蛋白與山羊抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白（1:10,000稀釋度）和AP結(jié)合的兔抗山羊IgG（1:30,000稀釋度）雜交。

化學(xué)發(fā)光檢測(cè)

化學(xué)發(fā)光檢測(cè)利用結(jié)合的酶來(lái)催化反應(yīng)，使可見(jiàn)光產(chǎn)生。一些化學(xué)發(fā)光的系統(tǒng)是基于過(guò)氧化物的形成，通過(guò)辣根過(guò)氧化物酶；其他系統(tǒng)利用1,2-二氧雜環(huán)丁烷和堿性磷酸酶（Cortese，2002）。這種技術(shù)有著顯色檢測(cè)的速度和安全性，且靈敏度水平與放射性檢測(cè)相當(dāng)。檢測(cè)可通過(guò)曝光到X射線(xiàn)膠片來(lái)實(shí)現(xiàn)，或直接在與化學(xué)發(fā)光兼容的數(shù)字成像系統(tǒng)上獲取圖像，它通常帶有高冷卻型CCD照相機(jī)，以避免電子噪音。化學(xué)發(fā)光底物可實(shí)現(xiàn)再次雜交。

目前有多種化學(xué)發(fā)光底物，為研究人員提供了不同的檢測(cè)靈敏度。傳統(tǒng)或低靈敏度的底物實(shí)現(xiàn)了皮克水平的蛋白檢測(cè)。盡管這些底物適合常規(guī)應(yīng)用，但它們無(wú)法檢測(cè)低豐度蛋白。新的高靈敏度底物，如Luminata™ HRP底物，實(shí)現(xiàn)了飛克水平的蛋白觀察。不過(guò)，在使用這些強(qiáng)大的底物時(shí)，往往需要優(yōu)化一抗和二抗的濃度（圖13，第29頁(yè)）。從低靈敏度底物轉(zhuǎn)換到高靈敏度底物（如Luminata™ Forte試劑）時(shí)，建議提高抗體稀釋度，以避免背景過(guò)高和非特異條帶的出現(xiàn)。

ECL免疫檢測(cè)的試劑可利用對(duì)-碘苯酚（PIP）和魯米諾（luminol）來(lái)制備（Hengen，1997）。PIP作為過(guò)氧化物酶對(duì)魯米諾活性的輔助因子，是增強(qiáng)可見(jiàn)光反應(yīng)所必需的。在苯酚增強(qiáng)劑與HRP共同使用時(shí)，光水平約提高100倍（Van Dyke和Van Dyke，1990）。這些自制的試劑被大量引用，產(chǎn)生出色的結(jié)果，但最高純度的魯米諾和PIP是關(guān)鍵（Hengen，1997）。

熒光檢測(cè)

熒光檢測(cè)采用與熒光基團(tuán)結(jié)合的抗體或熒光底物，后者在酶活性的位點(diǎn)發(fā)出熒光（化學(xué)熒光）。這種方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，熒光信號(hào)在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定，印跡可保存并再次照相。此外，廣泛的熒光基團(tuán)讓您能夠同時(shí)檢測(cè)單個(gè)樣品中的多個(gè)目標(biāo)蛋白（多重檢測(cè)）。直到最近，Western印跡中的熒光檢測(cè)仍受到大部分轉(zhuǎn)印膜高熒光背景的限制。與其他轉(zhuǎn)印膜相比，Immobilon®-FL轉(zhuǎn)印膜在廣泛的激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)下表現(xiàn)出低的背景熒光（圖15）。這種膜特別適合涉及到熒光免疫檢測(cè)的應(yīng)用，包括化學(xué)熒光底物和多重分析（圖16）。此外，Immobilon®-FL膜也可用于傳統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光或顯色檢測(cè)。

圖15. 負(fù)片影像顯示各種印跡膜上人血清中轉(zhuǎn)鐵蛋白的熒光檢測(cè)。血清稀釋度為：1:4,000、1:8,000、1:16,000、1:32,000、1:64,000。

圖16. 大腸桿菌細(xì)胞裂解液中過(guò)表達(dá)GST蛋白（帶cMyc或HA標(biāo)簽）連續(xù)稀釋物的Western印跡。(A) cMyc標(biāo)簽以一抗以及Qdot® 705（偽藍(lán)色）抗小鼠結(jié)合物檢測(cè)；(B) GST以Qdot 565（綠色）抗GST結(jié)合物檢測(cè)；(C) HA標(biāo)簽以一抗以及Qdot® 605（紅色）抗小鼠結(jié)合物檢測(cè)；(D) 印跡與三種抗體的組合雜交（多重分析）。印跡在柯達(dá)成像儀上掃描。數(shù)據(jù)由Quantum Dot公司提供。

• 再次雜交Immobilon® PVDF轉(zhuǎn)印膜

通過(guò)從印跡上剝離第一個(gè)抗體，并與另一個(gè)孵育，單個(gè)印跡能夠依次與多個(gè)抗體進(jìn)行分析。這對(duì)于共定位實(shí)驗(yàn)和方法優(yōu)化或樣品量有限時(shí)特別有用。

剝離過(guò)程破壞抗原抗體的鍵，將抗體溶解在周?chē)�的緩沖液中。這通常是通過(guò)去污劑和加熱的組合或暴露在低pH下來(lái)實(shí)現(xiàn)的。這兩種方法都不能去除顯色檢測(cè)系統(tǒng)所產(chǎn)生的有色沉淀物（如BCIP、4CN、DAB和TMB）。不過(guò)，仍然能用特異針對(duì)另一種目標(biāo)蛋白的抗體來(lái)分析印跡。

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