SDS的存在

一些研究表明，在SDS-PAGE凝膠的背景下，蛋白質與SDS分子結合，因此不能有效地與轉印膜結合。具體來說，在兩小時內監控BSA在標準槽轉印系統中的轉移，數據表明，在單個蛋白條帶中，分子分成多批從凝膠上轉移（圖8，第20頁）。在最初60分鐘內，約90%的BSA從凝膠上洗脫，在之后60分鐘內還有7%。在最初15分鐘內，部分洗脫的BSA被Immobilon®-P轉印膜吸附，而剩余的穿過，被Immobilon®-PSQ轉印膜吸附。而15分鐘后洗脫的BSA幾乎全被Immobilon®-P轉印膜吸附。

圖8. BSA的電轉移。25 pmol 125I標記的BSA在10-20%的梯度膠上通過SDS-PAGE來分辨。平衡后5分鐘，在槽轉印系統中將BSA轉移到Immobilon®-P轉印膜，并用Immobilon®-PSQ轉印膜來備份，利用25 mM Tris、192 mM甘氨酸和10%甲醇作為轉印緩沖液。系統以8V/cm極間距離運行。在15、30、60和120分鐘，取出凝膠/膜轉印夾。切下BSA條帶并計算。

最簡單的解釋是與高水平殘留SDS結合的BSA從凝膠上快速洗脫，無法被Immobilon®-P轉印膜所吸附。較慢洗脫的BSA能夠被Immobilon®-P轉印膜所吸附。

盡管去除凝膠上的SDS通常被認為是常規印跡的最好方法，但也有一些情況，說明在轉印緩沖液中添加少量SDS也是值得考慮的。一種情況是待轉移的蛋白質在缺乏SDS時溶解度很低。與細胞膜相關聯或不可缺少的蛋白質可能是非常疏水的，當SDS被去除后，在聚丙烯酰胺中會沉淀。高分子量蛋白質也在缺乏SDS時表現出溶解度的問題，特別是當暴露在樣品緩沖液的變性條件以及轉印緩沖液所使用的甲醇下。轉印緩沖液中補充SDS可幫助維持足夠的溶解度，以便允許從凝膠上洗脫（如Towbin和Gordon，1984；Otter等，1987；Bolt和Mahoney，1997）。轉印緩沖液中的SDS濃度不應超過0.05%，且應有足夠的平衡時間，以去除凝膠上過量的SDS。

改善高分子量蛋白質的轉印效率的其他方法包括延長轉印時間，最多21個小時（Erickson等，1982），或使用包含SDS和尿素的復合瓊脂糖聚丙烯酰胺凝膠（Elkon等，1984）。

電流和轉印時間

適當的電流和轉印時間對成功的轉印至關重要。電流過低和/或時間不足將導致轉印不徹底。相反，如果電流過高，蛋白質分子可能太快穿過膜而來不及被吸附。這對于較小的蛋白質來說可能是個值得注意的問題。通常，轉印系統都會附帶制造商關于電流和轉印時間的建議，它們應被作為參考指引。

優化條件可能仍然需要，這取決于丙烯酰胺的比例、緩沖液組分，以及感興趣蛋白質的分子量。一般來說，長的轉印時間最適合槽轉印系統，它通常需要冷卻裝置和轉印緩沖液的內部循環。然而，對于半干式轉印，延長轉印時間可能導致緩沖液耗盡、過熱和凝膠變干。如果太干，裝置可能被電極板之間的電弧損壞。

轉印緩沖液的pH值

轉印緩沖液的pH值是另一個重要的因素。如果蛋白質的等電點與緩沖液的pH值相同，則轉移不會發生。為了解決這一問題，可采用較高pH值的緩沖液（如CAPS）或較低pH值的緩沖液（如乙酸溶液）。

平衡時間

在蛋白質轉印的早年（70年代末期，80年代初期），大部分操作要求在轉印前平衡凝膠30分鐘。5英寸標準凝膠，或一邊長度超過5英寸，以及最小厚度>1 mm的凝膠需要延長平衡時間，來穩定凝膠的大小。隨著迷你凝膠逐漸普及，平衡時間也縮短，因為水和甲醇需要平衡的體積減少了。

標準的迷你凝膠可在5-10分鐘內達到尺寸的平衡，但SDS解離的動力學要慢得多，因此對于大部分迷你凝膠，建議平衡時間至少達到15分鐘。

注意：對于包含小肽的樣品，在沒有電流動力的情況下，也可發生肽段的快速遷移。在這種情況下，凝膠在轉印緩沖液中的平衡應限制在10分鐘以內。

在SDS-PAGE系統中，電泳緩沖液中添加了SDS。這種SDS集中在陰極槽內，電泳時跟著溴酚藍示蹤染料。由于大部分凝膠的運行是直到示蹤染料到達凝膠底部，此時所有過量的SDS仍殘留在凝膠中，并被帶入轉印操作。如果轉印前不允許SDS擴散到凝膠外，那么它將干擾蛋白質吸附。平衡時間可延長至30分鐘，且應使用足夠的緩沖液，將SDS稀釋到最低水平。

平衡時間對BSA電轉移的影響如圖9所示。在這項研究中，放射性標記的BSA通過SDS-PAGE來分辨，而凝膠在轉印緩沖液中的平衡時間在0至30分鐘。蛋白質被轉移到Immobilon®-P轉印膜上，后面有一塊備用的Immobilon®-PSQ轉印膜，以吸收Immobilon®-P轉印膜未截留的BSA。在轉印過程結束時，凝膠、主要印跡（Immobilon®-P轉印膜）和備份印跡（Immobilon®-PSQ轉印膜）上的BSA被定量。當平衡時間延長至30分鐘時，截留率提高到90%。研究發現其他蛋白質的表現類似。

圖9. 平衡時間對BSA電轉移到Immobilon®-P轉印膜的影響。125I標記的BSA在10-20%的梯度膠上通過SDS-PAGE來分辨。在指定的平衡時間后，BSA被轉移到Immobilon®-P轉印膜上，后面有一塊備用的Immobilon®-PSQ轉印膜，采用槽轉印系統，以25 mM Tris、192 mM甘氨酸和10%甲醇作為轉印緩沖液。系統以8V/cm極間距離運行。在2小時的轉印結束時，凝膠和膜被染色。BSA條帶被切下并計算。

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