生物通報道：規律成簇的間隔短回文重復CRISPR與內切酶Cas9的組合，原本是細菌抵御病毒的重要武器，現在這一組合已經成為了一個通用工具，被用于在真核生物中進行位點特異性的基因組修飾。

最近Nature Biotechnology雜志上發表了三個研究團隊的研究成果，研究人員深入分析了CRISPR的脫靶效應，并提出了非�？尚械慕鉀Q之道。

CRISPR系統修改目的基因的簡便性，讓幾乎所有實驗室都有可能隨心所欲的進行基因組編輯。你需要做的只是，在自己感興趣的細胞或生物中，表達Cas9內切酶和引導RNA（gRNA）。引導RNA是一段與目標DNA片段匹配的短RNA，它指導著CRISPR-Cas9的DNA剪切活性。

不過困擾其他定向核酸酶的老問題——脫靶效應，也同樣影響著CRISPR系統。人們發現，Cas9會在基因組的一些脫靶位點進行剪切。弗吉尼亞大學Mazhar Adli等人的研究顯示，在人類基因組中Cas9除了結合目的基因以外，還殃及了許多其他的位點。

Adli及其同事構建了失去酶活性的Cas9（dCas9），并將其與12種不同的gRNA搭配。隨后他們通過ChIP-seq技術，在HEK293T細胞中檢驗了dCas9在全基因組的結合情況。研究人員發現，脫靶結合的多少主要取決于gRNA。對于絕大多數gRNA而言，dCas9能結合幾十到幾百個脫靶位點（Kuscu et al., 2014）。研究顯示，具有酶促活性的Cas9的確會切割這些ChIP-seq鑒定的脫靶位點（盡管不是全部）。

這項研究告訴我們，CRISPR系統的特異性可能無法滿足某些應用的需求。應該怎么辦呢？Adli等人認為，可以用Cas9 nickase代替野生型Cas9進行基因組編輯。Cas9 nickase是一種突變型Cas9，只切割一條DNA鏈。（延伸閱讀：Nature子刊：黃行許教授解決基因組編輯的脫靶問題）

然而，哈佛大學David Liu研究組和麻省總醫院Keith Joung研究組找到了更好的辦法（Guilinger et al., 2014 and Tsai et al., 2014）。他們的策略是對Cas9進行基因工程改造，讓其依賴二聚化才能酶切，就像鋅指核酸酶（ZFN）和TALEN那樣。二聚化酶有著更嚴格的序列要求，理論上應該能夠大大減少脫靶位點的數量。

這兩個研究團隊不約而同地將Fok1核酸酶融合到了dCas9的N端，與ZFN和TALEN中的方向相反。他們發現，融合而成的二聚酶與Cas9的正確切割效率相差不多。Liu和Joung兩個團隊還通過深度測序，檢驗了野生型Cas9的那些脫靶位點，發現二聚酶顯著減少了可檢測到的脫靶事件。

生物通編輯：葉予

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