CRISPR技術(shù)的確在科學(xué)界掀起了基因組編輯的狂潮。在Pubmed中快速檢索“CRISPR”，目前已有900多項(xiàng)結(jié)果。當(dāng)然，每天還有新的科學(xué)家進(jìn)入這一領(lǐng)域，他們或許有許多疑惑。為此，Addgene請(qǐng)來(lái)了Broad研究院的CRISPR專家John Doench和Ella Hartenian，給大家介紹一些使用CRISPR的tips。

開始之前的重要考慮

通過(guò)CRISPR技術(shù)來(lái)編輯基因組帶來(lái)了許多令人興奮的選擇，不過(guò)需要仔細(xì)規(guī)劃才能達(dá)到期望的結(jié)果。第一個(gè)選擇在于你希望引入的編輯類型，小的插入缺失（InDel）或特定改變。小的插入缺失最常用于破壞基因的蛋白編碼能力，在Cas9核酸酶切割dsDNA后，非同源末端連接（NHEJ）容易出錯(cuò)的性質(zhì)往往會(huì)引入移碼突變。特定改變即插入表位或熒光標(biāo)記，或引入特定突變，必須依賴同源重組（HR）通過(guò)外源性模板來(lái)修復(fù)dsDNA斷裂。

如果你有興趣創(chuàng)建小的插入缺失，任何蛋白上都有許多可能的靶位點(diǎn)。在使用化膿性鏈球菌（S. pyogenes）的Cas9時(shí)，潛在的靶位點(diǎn)是[5’-20nt-NGG]和[5’-CCN-20nt]，因?yàn)樗�同樣高效地靶定DNA的編碼或非編碼鏈。最好靶定蛋白編碼區(qū)的N端，而不是C端，因?yàn)樗�出現(xiàn)在越上游，就越有可能創(chuàng)建出一個(gè)真正無(wú)效的等位基因。不過(guò)，在用同源重組修復(fù)時(shí)，靶位點(diǎn)的選擇就有更多的限制；當(dāng)切割位點(diǎn)距離修復(fù)模板的近端>30 nt時(shí)，效率急劇下降。

確定靶序列，減少脫靶效應(yīng)

避免Cas9的脫靶效應(yīng)是設(shè)計(jì)sgRNA中關(guān)鍵的一步。盡管控制脫靶效應(yīng)的規(guī)則仍處在起步階段，但一些準(zhǔn)則已經(jīng)被開發(fā)出來(lái)，并融入目前的設(shè)計(jì)算法。以下的生物信息學(xué)工具能幫助你確定那些表現(xiàn)出最大的序列獨(dú)特性的基因組位點(diǎn)：

張鋒實(shí)驗(yàn)室：http://crispr.mit.edu/
Michael Boutros實(shí)驗(yàn)室：http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html

此外，如何改善on-target活性，目前還知之甚少。我們似乎不可能完全預(yù)測(cè)到最特異、最具活性的CRISPR，因此，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)檢測(cè)多個(gè)不同的CRISPR，以確定on-target效果和off-target程度，這才是最重要的。

減少CRISPR技術(shù)脫靶效應(yīng)的一種方法是使用兩條sgRNA以及Cas9的“切口酶”版本。這種方法有助于提高特異性，從而減少脫靶的dsDNA斷裂。不過(guò)，此方法的缺點(diǎn)在于需要兩個(gè)靶位點(diǎn)，這意味著一些特定位置不適合創(chuàng)建dsDNA斷裂。當(dāng)然，如果可能的話，這是基因編輯的首選方法。

CRISPR導(dǎo)入的選擇

一旦靶位點(diǎn)確定，我們必須考慮如何導(dǎo)入。通常，CRISPR構(gòu)建體可以轉(zhuǎn)染到細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，或用病毒感染。如果使用逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒，不建議將產(chǎn)生的細(xì)胞用于長(zhǎng)期研究，因?yàn)榻M成型Cas9表達(dá)和脫靶效應(yīng)積累的潛在影響。瞬時(shí)表達(dá)，如轉(zhuǎn)染、電穿孔，或非整合型病毒（AAV或腺病毒），是建立穩(wěn)定細(xì)胞系的最理想選擇。同源重組的修復(fù)模板既可以是質(zhì)粒，也可以是單鏈oligo，與Cas9和sgRNA共同轉(zhuǎn)染。即使使用CRISPR技術(shù)，特定細(xì)胞中的同源重組率可能還是很低（<1-5%），因此細(xì)胞需要篩選。這一步可能是整個(gè)過(guò)程中最耗時(shí)的部分。

Addgene是一個(gè)以促進(jìn)科學(xué)共享為目的的非營(yíng)利性組織。目前它提供多個(gè)實(shí)驗(yàn)室的CRISPR載體，詳見http://www.addgene.org/。（生物通 余亮）

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