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蛋白質印跡手冊23：故障排查（下）[創新技巧]

【字體：大中小】 時間：2014年09月12日 來源：默克密理博

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　　蛋白質印跡出了問題？沒關系，下面的troubleshooting指南一定能幫助你找出可能的原因，并為你提供補救辦法。

3. 蛋白質觀察

癥狀	可能的原因	補救辦法
透照法檢測不佳	膜不合適	透照法最適合 Immobilon^®-P轉印膜。不建議使用硝酸纖維素或Immobilon^®-P^SQ轉印膜。
	在用甲醇潤濕前，膜未徹底干燥	確保膜在轉印后徹底干燥，才浸入20%的甲醇溶液中。一定要使用20%的甲醇溶液。
	印跡只用水飽和	用20%甲醇飽和印跡。
	印跡不夠飽和	將甲醇濃度提高到最多40%。
染色弱或不均勻	膜在染色前未用甲醇潤濕	膜必須用甲醇預潤濕；整張膜應均勻地從不透明變為半透明。
不均勻/有污點的結果	使用足夠量的孵育溶液，并確保孵育過程中膜被這些溶液完全覆蓋	所使用的容器應足夠大，讓溶液在印跡上自由移動。每次切勿在同一個容器中孵育超過一張印跡。此外，印跡的蛋白質一側應朝上，這樣就不會與容器的底面相互作用。
	氣泡	印跡的表面不應有任何氣泡。沿容器邊緣輕拉膜，以趕走氣泡。
	試劑質量不佳	所有的緩沖液和試劑應當是新鮮的，不含顆粒和污染物。使用Millex^®針頭式過濾器或Stericup^®、Steritop^®或 Steriflip^®過濾裝置來過濾緩沖液，抗體儲液可能需要離心。
背景染色高	蛋白質與膜的非特異性結合	確保使用干凈的電轉移設備和組件，以及高質量的試劑和Milli-Q^®水。

4. 免疫檢測

癥狀	可能的原因	補救辦法
信號弱	封閉試劑不適當	封閉劑可能對目的蛋白有親和力，從而掩蓋了蛋白，影響檢測。嘗試不同的封閉劑和/或降低封閉劑的量或暴露時間。
	抗體孵育時間不夠	增加孵育時間。
	抗體濃度太低，或抗體無活性	抗體溶液的反復凍融或細菌污染可能改變抗體的滴度或活性。提高抗體濃度或新鮮制備。
	檢測試劑過期	使用新鮮的底物并適當保存。過期的底物會降低靈敏度。
	蛋白質轉印的問題	優化蛋白質轉�。ㄒ娚衔模�。
	顯色檢測中的印跡干燥	如果使用顯色檢測系統，對比度不佳，那么印跡可能已干燥。嘗試用水重新潤濕印跡，以便最大限度提高對比度。
	自來水讓顯色檢測試劑失活	在準備試劑時使用Milli-Q^®水。
	疊氮化物抑制HRP	請勿在封閉液中使用疊氮化物。
	抗原濃度太低	轉印之間在凝膠中上樣更多的抗原。
無信號	抗體濃度太低	增加一抗和二抗的濃度。
	HRP抑制	HRP標記的抗體不應使用在包含疊氮化鈉的溶液中。
	一抗是針對天然蛋白的	在非變性凝膠中分離蛋白質，或使用針對變性抗原的抗體。
不均勻的印跡	印跡上出現指紋、折痕或鑷子痕跡	不要觸摸或折疊膜；使用手套和鈍端鑷子。
有污點的背景	封閉試劑中有結塊	通過0.2 μm或0.45 μm的Millex^®針頭式過濾器裝置來過濾封閉液。
有污點的背景	HRP標記的二抗中有聚集物	通過 0.2 μm或0.45 μm的Millex^®針頭式過濾器裝置來過濾二抗溶液。
背景高	清洗不夠	增加清洗量和次數。利用Millex^®針頭式過濾器或Steriflip^®過濾裝置來預過濾所有溶液，包括轉印緩沖液。
	二抗（酶結合）抗體濃度過高	增加抗體稀釋度。
	蛋白質之間相互作用	在清洗和檢測溶液中使用吐溫20（0.05%），以減少蛋白質之間相互作用，并提高信噪比。
	Immobilon^®-P^SQ轉印膜上的免疫檢測	增加封閉液的濃度或量，以補償更大的膜表面積。在清洗緩沖液中加入最多0.5 M NaCl和0.2% SDS，并將清洗時間延長至2小時，可減少頑固的背景。
	試劑質量不佳	使用高質量的試劑和Milli-Q^®水。
	封閉液和抗體之間的交叉反應性	使用不同的封閉液或在清洗液中加入吐溫20去污劑。
	膠片曝光過度	縮短曝光時間。
	孵育過程中膜變干	在孵育過程中使用足量溶液，以覆蓋膜。
	抗體質量不佳	使用高親和力的純化抗體。
	檢測試劑過量	在曝光前徹底排干印跡。
頑固背景	非特異性的結合	使用高鹽清洗。（操作3.4，第54頁）
癥狀	可能的原因	補救辦法
背景高（快速免疫檢測）	在快速免疫檢測過程中膜濕透	減少抗體稀釋液中的吐溫20（< 0.04%）去污劑。在孵育過程中輕柔搖動。在電轉移之后用Milli-Q^®水沖洗印跡，以去除凝膠上殘留的SDS。在開始任何檢測操作之前，確保印跡徹底干燥。
	免疫檢測之前膜用甲醇潤濕	切勿預潤濕膜。
	免疫檢測之前膜未徹底干燥	確保膜已徹底干燥，再開始檢測。
非特異結合	一抗濃度過高	增加一抗稀釋度。
	二抗濃度過高	增加二抗稀釋度。
	抗原濃度過高	降低凝膠上蛋白的上樣量。
膠片上圖像倒轉（黑色背景上出現白色條帶	太多HRP結合的二抗	降低HRP結合的二抗濃度。
小蛋白的檢測不佳	小蛋白被大的封閉分子（如BSA）所遮蔽	考慮使用酪蛋白或低分子量的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。表面活性劑，如吐溫和Triton^® X-100應減少。避免用抗體和清洗液孵育過長時間。

5. 熒光檢測

癥狀	可能的原因	補救辦法
整體背景高	印跡膜的背景熒光高	使用Immobilon^®-FL轉印膜。
整體背景高	封閉試劑未針對熒光檢測而優化	使用Bløk^®-FL Noise-canceling試劑，為熒光Western印跡而優化。
多重分析的問題	實驗設計	兩個抗體必須來自不同的宿主物種，這樣它們才能被不同特異性的二抗所區分。在使用兩個一抗之前，需要分別在單獨的印跡上檢測條帶模式，以確定條帶出現的位置。在雙色檢測中應使用交叉吸附過的二抗。
背景有污點	處理印跡時有灰塵/粉末顆粒	戴上無粉塵手套處理印跡，并清潔掃描儀的表面。
信號低	濕的印跡	干燥印跡可提高信號強度。印跡可重新潤濕后再掃描。在掃描時切勿用保鮮膜或Saran™膜包住印跡。
	印跡光漂白	盡管熒光染料通常能提供持久的穩定信號，但一些熒光染料會很容易發生光漂白。為了防止光漂白，在二抗孵育和清洗時應保持讓膜避光，直至準備進行掃描。將顯像好的印跡保存在暗處，以便后續成像。
	錯誤的激發波長	在印跡成像或使用發射濾光片時遵照染料制造商的使用說明。