Western blot實(shí)驗(yàn)的失敗，那都是家常便飯。據(jù)Bio-Rad統(tǒng)計(jì)，大約一半的研究人員表示，他們Western blot的失敗率至少在25%。如此高的失敗率，難怪會(huì)讓人心慌慌。況且整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程那么長(zhǎng)，辛苦一整天，得到一張“白板”，還真是有點(diǎn)不甘心。

其實(shí)，我們會(huì)如此焦慮，是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)過程中幾乎沒什么機(jī)會(huì)來檢查結(jié)果是否和預(yù)期的一致。我們只能通過預(yù)染marker來了解大致情況。如果在Western blot流程中加入檢查點(diǎn)，確保每一步都獲得可靠的結(jié)果，那勢(shì)必能減輕研究人員的焦慮。基于這一考慮，Bio-Rad推出了V3 Western Workflow。

這個(gè)V3流程是在傳統(tǒng)的Western流程中引入了創(chuàng)新的免染（Stain-Free）技術(shù)。操作過程并沒有什么變化，但能夠大大縮短整個(gè)實(shí)驗(yàn)的時(shí)間。同時(shí)，免染技術(shù)讓研究人員能看到凝膠和轉(zhuǎn)印膜上的蛋白質(zhì)，而無需染色，也不會(huì)影響免疫檢測(cè)中的抗體雜交。

V3，這代表什么？據(jù)Bio-Rad介紹，V3即V+V+V，但這三個(gè)V有著不同的涵義。第一個(gè)V代表Visualize。在電泳結(jié)束后將凝膠放入Bio-Rad的成像系統(tǒng)中1分鐘激活成像，即可得到一張類似于考馬斯藍(lán)染色的圖像，從而判斷分離效果。第二個(gè)V是Verify。在轉(zhuǎn)印結(jié)束后，通過成像系統(tǒng)可以看到印跡膜上的蛋白，從而判斷轉(zhuǎn)印的效率。至于第三個(gè)V，就是Validate，利用膜上的總蛋白作為內(nèi)參來進(jìn)行定量歸一化。

加州大學(xué)戴維斯分校的助理教授Aldrin Gomes認(rèn)為，這些檢查點(diǎn)的確很有用。“我們能夠?qū)δ�膠成像，而無需外部染料，并快速確定凝膠上的樣品是否有問題。在轉(zhuǎn)印之后，我們同樣對(duì)凝膠成像，如果任何一步有問題，我們就停下來。”這個(gè)停下來，不僅節(jié)約了抗體和時(shí)間，也是為了總結(jié)經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)后再出發(fā)。

V3 Western 流程總共包含五步：

1. 蛋白電泳。利用Mini-PROTEAN® TGX Stain-Free預(yù)制膠或Criterion™ TGX Stain-Free預(yù)制膠，以及標(biāo)準(zhǔn)的Tris/甘氨酸緩沖液，快速分離蛋白質(zhì)。TGX Stain-Free預(yù)制膠采用一種獨(dú)特的配方，能夠在15分鐘內(nèi)快速分離蛋白質(zhì)。

2. 觀察分離。通過免染技術(shù)，將凝膠放入ChemiDoc Touch或ChemiDoc™ MP成像系統(tǒng)中激活1分鐘，即可觀察蛋白分離。此技術(shù)的原理是將蛋白膠浸泡在三氯乙酸或氯仿中，然后通過紫外光照射。在三氯化合物存在時(shí)，紫外光驅(qū)使色氨酸發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)物會(huì)發(fā)出可見區(qū)內(nèi)的光，從而實(shí)現(xiàn)蛋白條帶在膠上的定位。這樣無需染色，也能對(duì)蛋白分離的情況了如指掌。

3. 蛋白轉(zhuǎn)印。利用TransBlot Turbo轉(zhuǎn)印系統(tǒng)和TGX Stain-Free預(yù)制膠，最快3分鐘即可完成轉(zhuǎn)印。TransBlot Turbo，又稱為全能型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，一次可轉(zhuǎn)印4塊mini膠或2塊midi膠。它采用了一種新配方的轉(zhuǎn)印緩沖液，并使用了一種特殊材質(zhì)的濾紙。這種組合能夠承受更大電流，使轉(zhuǎn)印不僅更快，而且更完全。

4. 轉(zhuǎn)印驗(yàn)證。同樣，利用ChemiDoc Touch或ChemiDoc MP成像系統(tǒng)，能夠?qū)�PVDF或NC膜上的蛋白進(jìn)行觀察，即時(shí)檢查蛋白轉(zhuǎn)印的效果，而不需要麗春紅染色。如果轉(zhuǎn)印有問題，那么后續(xù)就不需要浪費(fèi)寶貴的一抗了。

5. Western blot驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)當(dāng)然少不了參照。過去的Western blot實(shí)驗(yàn)通常以看家基因作為內(nèi)參，來確定蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量。然而，研究也發(fā)現(xiàn)，這些蛋白在病變組織與正常組織間、不同的正常組織間以及同一組織的不同部位都呈現(xiàn)出差異表達(dá)。因此，如今人們傾向于選擇總蛋白作為內(nèi)參。利用ChemiDoc Touch或ChemiDoc™ MP成像系統(tǒng)以及Image Lab軟件，研究人員能夠以總蛋白來進(jìn)行定量歸一化，從而消除實(shí)驗(yàn)誤差，得到更為可靠的結(jié)果。

V3 Western流程中有三款儀器可供選擇，包括ChemiDoc Touch、ChemiDoc MP和Gel Doc EZ系統(tǒng)。其中，ChemiDoc Touch是去年底上市的新產(chǎn)品。它采用創(chuàng)新的鏡頭和光學(xué)組件、超高品質(zhì)CCD，將數(shù)字成像系統(tǒng)的靈敏度和圖像質(zhì)量真正提高到膠片級(jí)別，能產(chǎn)生可立即發(fā)表的圖像。如何在這三款儀器中做出選擇，請(qǐng)看下表。

以往一整天才能獲得的結(jié)果，如今借助這些新穎的技術(shù)和儀器，6小時(shí)就能完成，而且不是白板哦。老板再也不用擔(dān)心我的Western blot了。（生物通 余亮）

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