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挑戰(zhàn)極限：皮克級鏈特異性RNA-Seq完整解決方案

【字體：大中小】 時(shí)間：2015年12月14日 來源：Takara

編輯推薦：

　　Clontech一直是微量樣品解決方案先驅(qū)，最新的SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico-Input Mammalian采用全新的Zap R R-Probes核糖體cDNA去除技術(shù)，在合成全長cDNA文庫后去除rRNA來源的cDNA，可以250pg-10ng任意品質(zhì)哺乳動物總RNA起始，5小時(shí)內(nèi)即可構(gòu)建Illumina®-ready cDNA文庫。

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• 皮克級樣品起始—可以250pg-10 ng人，小鼠或大鼠總RNA起始
• 多能—可以多種組織樣品（包括FFPE和LCM樣品）和任意品質(zhì)RNA制備文庫，獲得高重復(fù)再現(xiàn)數(shù)據(jù)
• 保留鏈來源信息—轉(zhuǎn)錄本鏈來源信息識別準(zhǔn)確度高
• 快速，一體化流程—整體流程只需~5 h
• 無縫銜接Illumina測序—最多可制備96個(gè)多重標(biāo)簽Illumina®-ready文庫

5h內(nèi)即可制備Illumina®-ready鏈特異性測序文庫：

完美結(jié)合隨機(jī)引物起始法，SMART技術(shù)&LNA技術(shù)及全新的核糖體cDNA去除技術(shù)，可以制備包含編碼和非編碼RNA信息的高代表性文庫。

表現(xiàn)出色：

可以在皮克級樣品起始的情況下，獲得高靈敏度、高重復(fù)再現(xiàn)性結(jié)果，并且適用樣品范圍廣泛。

簡介

鏈特異性總RNA-Seq是RNA-Seq中的重要應(yīng)用，通過鏈特異性測序可以區(qū)分重疊基因邊界，進(jìn)行全面基因注釋和定量長非編碼RNAs。傳統(tǒng)的總RNA-Seq文庫制備方案通常需要100 ng-1 ug較高的RNA起始量，并且在cDNA合成和文庫制備之前需要從總RNA中去除rRNA。對于挑戰(zhàn)性樣品，如激光顯微切割樣品RNA，很難獲得10 ng起始樣品，并且rRNA去除過程會進(jìn)一步增加樣品損失，導(dǎo)致文庫質(zhì)量下降。Clontech一直是微量樣品解決方案先驅(qū)，最新的SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico-Input Mammalian采用全新的Zap R R-Probes核糖體cDNA去除技術(shù)，在合成全長cDNA文庫后去除rRNA來源的cDNA，可以250pg-10ng任意品質(zhì)哺乳動物總RNA起始，5小時(shí)內(nèi)即可構(gòu)建Illumina®-ready cDNA文庫。

隨機(jī)引物起始，捕獲全轉(zhuǎn)錄組信息

與oligo dT引物相比，隨機(jī)引物可以獲得代表性更全面的轉(zhuǎn)錄組信息，同時(shí)更適用于降解樣品。隨機(jī)引物可以捕獲編碼和非編碼RNA，這對于基因表達(dá)、調(diào)控研究和人類疾病研究尤為重要。

SMART，LNA和核糖體RNA去除技術(shù)確保獲得高靈敏度鏈特異文庫

結(jié)合了SMART（Switching Mechanism At 5' end of RNA Template）技術(shù)和LNA（Locked Nucleic Acid）技術(shù)，提高了模板轉(zhuǎn)換反應(yīng)穩(wěn)定性，同時(shí)帶有方向信息的模板轉(zhuǎn)換反應(yīng)保留了RNA的鏈來源信息。

不同樣品、不同起始量都表現(xiàn)出色

為檢測SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico-Input Mammalian在超出推薦起始范圍的表現(xiàn)，分別使用100pg-10 ng的小鼠腦部總RNA制備文庫，每個(gè)起始量2個(gè)技術(shù)重復(fù)。

100 pg- 10 ng總RNA起始測序數(shù)據(jù)
RNA樣品	小鼠腦部總RNA
起始量（ng）	10		1		0.25		0.1
文庫產(chǎn)量（ng/μl）	10.5	14.8	9.93	8.3	6.91	7.48	5.76	7.26
讀段數(shù)（millions）	2.6（雙端測序）
轉(zhuǎn)錄本數(shù)量 FPKM>1	12,714	12,709	12,744	12,725	12,540	12,615	12,286	12,528
皮爾遜/斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)	0.99/0.93		0.99/0.93		0.98/0.92		0.97/0.90
每個(gè)生物學(xué)注釋鏈識別準(zhǔn)確率（%）	97.7	97.7	97.7	97.7	97.7	97.7	97.7	97.6
總讀段比例（%）
外顯子	22.6	22.8	23.4	23.5	23.3	23.1	23.1	22.8
內(nèi)含子	35.6	35.7	35.3	36.2	35.9	35.5	36.1	35.1
基因間區(qū)	8.3	8.2	8.2	8.2	8.0	8.0	7.8	7.8
rRNA	11.2	10.5	10.8	9.9	9.7	9.7	8.8	9.5
線粒體	8.8	8.7	8.3	8.5	8.3	8.4	7.5	7.9
重復(fù)率（%）	12.8	12.5	17.3	17.8	31.3	28.8	44.2	40.2

不同RNA起始量情況下，測序指標(biāo)一致。分別使用100 pg-10 ng的小鼠腦部總RNA制備RNA-Seq文庫，每個(gè)起始量2個(gè)重復(fù)。“PCR1”所有的文庫都進(jìn)行5輪擴(kuò)增，“PCR2”對于10 ng，1ng，250 pg和100 pg文庫分別進(jìn)行10,13,15和16輪PCR擴(kuò)增。

從上表可以看出不同起始量的情況下，測序數(shù)據(jù)非常相似。FPKM>1（fragments per kilobase of exon per million reads）的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量超過12,000，并且保留了鏈來源信息。讀段中比對到核糖體cDNA的比例在~9%到12%之間，不進(jìn)行核糖體cDNA去除的情況下，比對到核糖體cDNA的比例~67%（數(shù)據(jù)未展示）。以250pg和10ng RNA 起始制備的文庫具有高度一致性（散點(diǎn)圖，下圖）。

推薦起始量范圍內(nèi)均可獲得高復(fù)再現(xiàn)性結(jié)果。對采用250 pg和10 ng小鼠腦部總RNA制備的文庫的FPKMs進(jìn)行比較分析。FPKM數(shù)值顯示為對數(shù)標(biāo)尺。只在其中一個(gè)文庫中表現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄本在圖中表現(xiàn)為沿X軸和Y軸的散點(diǎn)。

SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico-Input Mammalian采用的核糖體cDNA高效去除技術(shù)適用于多種組織（人腦、胚胎、骨骼肌、心臟和脾臟；大鼠腦、肝臟和腎臟；小鼠腦和肝臟）。分別采用R-Probes切割核糖體cDNA或不切割處理樣品制備文庫。在處理的情況下，比對到rRNA的讀段數(shù)量顯著降低，約占總讀段數(shù)的10-30%，不同的組織間有所不同（見下表）。同時(shí)，對轉(zhuǎn)錄本識別有用的讀段數(shù)（外顯子）得到了5-10倍的提升。

組織類型	腦		胎盤		骨骼肌		心臟		脾臟
核糖體cDNA去除	（-）	（+）	（-）	（+）	（-）	（+）	（-）	（+）	（-）	（+）
文庫產(chǎn)量（ng/μl）	18.1	5.2	10.2	3.7	11.5	2.4	9.9	3.8	10.6	3.2
轉(zhuǎn)錄本數(shù)量FPKM>1	12,581	15,693	9,079	13,095	6,619	11,879	7,667	14,448	9,900	15,798
每個(gè)生物學(xué)注釋鏈識別準(zhǔn)確率（%）	97.6	97.6	97.8	97.8	98.5	98.5	98.4	98.4	98.3	98.1

動物	大鼠						小鼠
組織類型	腦		肝臟		腎臟		腦		肝臟
核糖體cDNA去除	（-）	（+）	（-）	（+）	（-）	（+）	（-）	（+）	（-）	（+）
文庫產(chǎn)量（ng/μl）	18.7	4.3	20.8	2.7	18.8	3.7	15.8	14.2	18.0	5.2
轉(zhuǎn)錄本數(shù)量FPKM>1	8,618	12,477	5,645	10,647	7,939	13,197	10,465	12,627	8,001	10,922

提升了人、嚙齒類動物組織中外顯子比對率和轉(zhuǎn)錄本識別數(shù)量。分別采用250 pg人總RNA和250 或500 pg大鼠、小鼠總RNA制備文庫，對未經(jīng)R-Probes處理（-）和處理（+）文庫的各讀段分布情況進(jìn)行分析。

創(chuàng)新的核糖體cDNA去除技術(shù)可以在有效維持基因代表性的同時(shí)，顯著提高低于10ng RNA起始的基因檢測數(shù)。分別對人腦部和心臟R-Probes處理和非處理文庫進(jìn)行比較分析，我們可以看到處理和非處理文庫具有高度的一致性（散點(diǎn)圖）。這表明核糖體cDNA去除技術(shù)特異針對rRNA，沒有顯著的脫靶效應(yīng)。

核糖體cDNA去除和非去除文庫具有高度一致性。分別采用250 pg人腦部或心臟總RNA制備文庫，對經(jīng)過核糖體cDNA去除（+）和非去除（-）處理（如分別經(jīng)過或非經(jīng)過R-Probes處理）文庫的FPKMs進(jìn)行比較分析。FPKM數(shù)值顯示為對數(shù)標(biāo)尺。只在其中一個(gè)文庫中表現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄本在圖中表現(xiàn)為沿X軸和Y軸的散點(diǎn)。

不同質(zhì)量樣品的完整解決方案

與其他的SMARTer Stranded Kits一樣，最新的SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico-Input Mammalian整合了RNA剪切流程，可以使RNA片段化以適應(yīng)Illumina測序平臺要求。同時(shí)也提供了非剪切流程用于已片段化或降解樣品。可以有效捕獲~100 nt以上的RNA片段（下圖），是微量降解樣品的理想選擇。

高效捕獲降解RNA。上圖為以250 pg高品質(zhì)（RIN8）或高度降解人總RNA（RIN 2.5）分別按照SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico-Input Mammalian中4 min剪切操作流程（RIN 8）或非剪切流程（RIN 2.5）進(jìn)行文庫制備后插入片段的分布情況。RNA-Seq文庫采用Illumina MiSeq® 平臺進(jìn)行雙端測序。對于特定長度插入片段的比對數(shù)量與文庫中總比對片段數(shù)量進(jìn)行了均一化處理。排除了比對到rRNA和線粒體基因組的片段。

綜上，SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico-Input Mammalian是針對皮克級哺乳動物總RNA挑戰(zhàn)性樣品，進(jìn)行鏈特異性測序文庫制備的完整解決方案。SMART技術(shù)&LNA技術(shù)和核糖體rRNA去除技術(shù)，確保可以在250 pg-10 ng推薦范圍內(nèi)獲得穩(wěn)定、可靠的結(jié)果，同時(shí)，實(shí)驗(yàn)顯示在100 pg起始的情況下也可獲得理想結(jié)果。本試劑兼容高質(zhì)量、部分降解和低品質(zhì)RNA，可以獲得穩(wěn)定、重復(fù)再現(xiàn)性好的結(jié)果，并且適用樣品類型廣泛。5小時(shí)內(nèi)，可以來源于多種樣品和品質(zhì)的微量總RNA起始制備Illumina®-ready文庫，用于編碼和非編碼RNA分析，是新一代RNA-Seq文庫制備的重大進(jìn)步。

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