過去6年，生物通一直在追蹤生命科學領域最前沿的創新產品，將其介紹給大家。2014年，生物通繼續搜羅新上市的產品，為大家奉上一場技術盛宴。經過一個半月的網頁和微信投票以及專家評鑒，2014生命科學十大創新產品終于出爐。

Pacific Biosciences公司的測序儀雖說之前也上過榜，但這一次，它再度升級了測序聚合酶和化學染料（P6-C4），讓PacBio測序儀的平均讀取長度提高到10,000 bp或者更長，有>50%的序列長度都超過了14,000 bp，最長讀長甚至超過40,000 bp。這不僅僅是數字上的增加，也帶來了二代測序無法實現的應用。2014年，PacBio技術發表在多個重要期刊上，而儀器銷量也節節攀升，這體現了它的價值正為更多人所認可。

如此看來，PacBio測序儀被評為2014生命科學創新產品，也是理所當然的。為了讓大家更好地了解這一產品，生物通采訪了PacBio中國地區代理商 – 基因有限公司的技術專家。

Q：PacBio今年的升級主要體現在哪些性能的改善？這具有什么意義？

A：2014年10月下旬，目前市面上唯一的第三代測序設備供應商Pacific Biosciences再度升級了測序聚合酶和化學染料試劑（P6-C4），進一步增加了其原本就傲視群雄的序列讀取長度，N50超過了14 kb，這無疑是測序屆爆發的又一枚超級炸彈。

P6-C4試劑可以將PacBio的平均讀取長度提高到10,000 bp或者更長，有>50%的序列長度都超過了14,000bp，最長讀長> 40,000bp，在業界遙遙領先。并且，通量上也有了進一步的提高，升級后每個SMRT Cell的有效數據產出量高達500 Mb-1 Gb。這種性能的提高，其中一部分原因是PacBio在原有C3試劑的光保護染料（photo-protected dyes of the C3 chemistry）基礎上進行了升級，新的化學試劑同時結合了C2的精確度與C3的讀取長度兩種優點。PacBio建議用戶采用新的化學試劑來實現所有基于PacBio測序儀的相關應用。

本次升級同時發布的還有新的軟件SMRT® Analysis v2.3。軟件包括改進的長擴增子分析，Iso-Seq™應用，Quiver以及CCS，同時還有性能的提升。這些更新進一步增強了結果的準確度，加快了分析速度，并且為混合的各種大小的擴增子分析如全長HLA Class I 和Class II 基因提供了更多的選擇。

關于P6-C4試劑的具體表現，美國最好的植物科學研究中心---密蘇里州Danforth植物科學中心的Robert Van Buren于2015年1月10日-14日在美國圣地亞哥舉辦的第23屆國際動植物基因組大會上做了介紹。他采用PacBio P6-C4試劑對基因組非常復雜的黍草進行De novo Assembly，做了65×的測序深度，用了23個SMRT Cells，得到了18 Gb的數據，平均讀長為12.872 kb，N50為16.485 kb，該植物的端粒區含有長度為5-10 kb的TTTAGGG重復，PacBio幫助他們成功地跨越了該區域。

除了長讀長在動植物領域帶來的重大改善，越來越多的基因組測序中心也開始關注于人類的疾病基因組測序，需要產生"Medical Grade Information“，也就是醫學級數據，二代測序受制于其技術原理，很多情況下，無法得到準確的定位和定量序列信息，信息并不完整，垃圾數據含量過大，一些基因的結構異常，如多達幾百bp甚至更長的重復序列tandem repeat，大片段的易位translocation，二代測序都無法發現，這些都是無法通過加深測序深度及生物信息學分析進行彌補的。而測序讀長長，就可以解決在二代測序視野中無法解決的此類問題。

More Than Longer，豈止于長。

Q：PacBio今年發表了不少好文章，是否能挑選有代表性的文章給大家介紹一下？

A：不得不提的一篇文章來發表在2014年11月10日的《自然》（Nature）雜志上。該文利用PacBio單分子實時測序測序技術，揭示出了人類基因組中成千上萬從未見過的遺傳變異。這些研究發現關閉了長期以來因無法測序造成的許多人類基因組作圖缺口，這一發現被業界評論為首次構建了白金人類基因組！

領導這一研究小組的是華盛頓大學基因組學系教授、霍華德•休斯醫學研究所研究員、弗雷德•哈欽森癌癥研究中心人類生物學部兼職教授Evan Eichler博士，其主要從事于基因組學與生物信息學研究，是國際上進行人和其他靈長類動物比較功能基因組學與生物信息學研究的頂尖科學家。在Cell、Nature、Science等國際頂尖學術期刊上發表了具有重要影響力的論文260多篇。

了解PacBio單分子測序儀的更多應用

Eichler說：“長期以來科學家們對許多疾病的遺傳病因都感到困惑不解。這一稱作為單分子、實時DNA測序(SMRT)的新技術，使得研究人員現在鑒別出這些疾病背后的潛在遺傳突變成為了可能。現在，我們進入到了以往對我們來說不透明的一個遺傳變異的全新領域。”到目前為止，科學家們還只能確定大約一半遺傳性疾病的遺傳病因。盡管無數科研人員在經年累月地進行研究，但人們還是未能找到許多人類疾病和特征背后的遺傳因素，例如身高等家族特征和二型糖尿病患病風險。這一謎題被稱為“遺傳性缺失”（missing heritability）。導致這一問題的一個原因在于，標準的基因組測序技術無法精確繪制基因組許多組成區域的圖譜。這些方法是通過排列通常大約為100個堿基長度的、億萬的重疊的DNA小片段，隨后分析它們的DNA序列來構建基因組圖譜。這種方法已成功繪出了數百萬人類基因組中的小變異。這些由單核苷酸堿基替換引起的變異，稱作為單核苷酸多態（SNP）。但由于一些技術原因，以往科學家們無法可靠地檢測出長度在大約50-5000個堿基之間的變異。

新研究中所采用的這一SMRT技術使得測序和讀取長度超過5000個堿基的DNA片段成為可能，比標準的基因測序技術還要長。這一由Pacific Biosciences開發的“長讀長”技術，使得研究人員能夠構建出相比以往更高分辨率的基因組結構變異圖譜。研究的主要作者、Eichler實驗室博士后Mark Chaisson開發出了這種方法，使得利用這一數據以堿基對分辨率來檢測結構變異成為了可能。為了簡化他們的分析，研究人員利用了來自葡萄胎（hydatidiform mole）的基因組。葡萄胎是由精子與缺乏母源DNA的卵子受精所導致的一種異常生長物。葡萄胎的基因組織只包含每個基因的一個拷貝，而非存在于正常細胞中的兩個拷貝，簡化了搜尋遺傳變異。在葡萄胎中應用這一新方法，研究人員鑒別并測序了與基因組研究中標準人類參考基因組不同的26,079個片段。

Eichler說，其中大多數的變異（大約22,000個）從未被報道。“這些研究結果表明，我們錯失了很多的變異。”這一技術還使得Eichler和同事們繪制出了160個基因組片段的圖譜，在過去一直難以對這些稱作為常染色體缺口（euchromatic gaps）的片段進行測序。他們的努力關閉了50個這樣的缺口，縮小了其他40個缺口。這些缺口包括一些重要的序列，一些基因的組成序列以及幫助控制基因表達的一些調控元件。在這些缺口中的一些DNA片段顯示出已知對大腸桿菌有毒的標記。大腸桿菌是常用于一些基因組測序過程的一種細菌。如果將這樣的DNA序列置于大腸桿菌中，有可能細菌會刪除這一DNA。”這或許可以解釋為什么不能采用標準方法來對其進行測序。他補充說：“這些缺口還攜帶了采用標準的測序方法無法很好復制的復雜序列。這些序列在人與人之間存在著廣泛的差異，它們有可能是一些遺傳不穩定性熱區。”

Eichler預測：“在五年內，會有一種長讀長測序技術將使得臨床實驗室能夠從一端到另一端測序患者的染色體。‘是的，你具有大約3百萬-4百萬的SNPs以及插入缺失，你還具有大約3萬-4萬個結構變異。在其中，有一些結構性變異和少數的SNPs是你易患某種疾病的原因。’知道所有這些突變將改變游戲的規則。”

Q：PacBio在2015年預計還會有哪些改進？

A：2015年，PacBio公司計劃將其測序通量提高4倍，進一步提高測序reads長度，增加樣品制備操作手冊及多個數據分析的應用程序。總結起來就是更高（通量）、更長（讀長）、更快（分析）。而這一切的升級均來自于試劑耗材，用戶無需更換現有儀器。

近日，該公司首席科學官Jonas Korlach在官網上發表博客表示，PacBio公司計劃提高PacBio RS II測序平臺的通量，使每SMRT cell一次運行可輸出超過4 Gb數據，平均讀取長度增加到15-20 kb。去年秋天該公司升級了測序聚合酶和化學染料(P6-C4)，使每個SMRT Cell 數據輸出量從0.5G提升到1GB，平均讀長達到10-15KB。最初的PacBio RS II平臺，一天運行16個SMRT Cell只能產生6.4G的原始數據。PacBio公司計劃通過提升化學試劑，操作流程及軟件來提高測序質量。包括將單一聚合酶加載到芯片上，從而提高裝載效率。

此外，該公司計劃提升樣本制備流程并將其簡單化，為混合樣本添加條形碼，發布長插入片段和全長cDNA文庫的操作手冊。在數據分析方面，PacBio公司計劃與生物信息學團隊合作開發更快的de novo組裝基因組的算法，進一步開發Falcon assembler及其他軟件來解決二倍體或多倍體基因組的分析工作，簡化全長轉錄本測序、Iso-Seq™全長轉錄本/異構體測序以及人類白細胞抗原（HLA）單體型定相的工作流程。