生物通報道  來自華南農業(yè)大學的研究人員報告稱，他們開發(fā)出了一種適用于在單子葉植物和雙子葉植物中，實現(xiàn)方便、高效多重基因組編輯的強大的CRISPR/Cas9系統(tǒng)。研究成果在線發(fā)表在Cell出版社旗下子刊《Molecular Plant》雜志上。

領導這一研究的是華南農業(yè)大學生命學院長江特聘教授劉耀光（Yao-Guang Liu）。其主要研究領域為植物基因工程、水稻基因的定位與克隆、水稻分子生物學。

近年來，各種遺傳工具如潮水般涌現(xiàn)，尤其是序列特異性的核酸酶為位點特異性基因組編輯帶來了重大的突破。鋅指核酸酶（ZFNs）是利用3個鋅指結構域來識別DNA，每個鋅指結構域識別3個堿基。轉錄激活因子樣效應物核酸酶(TALENs)則通過源自植物病原菌黃單胞菌 的TAL效應子來結合DNA。TAL效應子中的DNA識別單位幾乎是完全相同的串聯(lián)重復單位；每個單位識別一個堿基。盡管已有研究報道利用ZFNs和TALENs成功實現(xiàn)了基因打靶，但構建ZFNs的結合結構域在技術上相對困難，TALENs結合結構域的重復特性過于復雜，引發(fā)了人們對于載體在細菌和植物基因組中穩(wěn)定性的擔憂。此外，ZFNs和TALENs是以二聚體形式發(fā)揮功能也使得載體構建和轉化過程變得更加的復雜。

新基因編輯工具CRISPR/Cas9的出現(xiàn)給這一領域帶來了新的突破（延伸閱讀：華裔學者Nature子刊提高CRISPR/Cas9基因組編輯精確度）。這一系統(tǒng)借助于一條序列特異性的單導向RNA (single-guide RNA,sgRNA)將Cas9蛋白引導至靶位點處發(fā)揮核酸酶作用。不同于ZFNs和TALENs利用蛋白結合結構域，CRISPR/Cas9的位點特異靶向性是由sgRNA的前20個核苷酸所決定。盡管現(xiàn)已被應用于包括植物在內的多種生物體中進行基因組打靶，但當前大多數(shù)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物中還只能用于改變一個或少數(shù)幾個的靶位點。

在這篇新文章中研究人員報告稱，他們利用設計合成的植物優(yōu)化密碼子Cas9基因，構建出了一種強大的CRISPR/Cas9載體系統(tǒng)，適用于在單子葉植物和雙子葉植物中實現(xiàn)方便、高效的多重基因組編輯。他們設計出了一種基于PCR的程序來快速構建多個sgRNA表達盒，并采用Golden Gate ligation或Gibson Assembly連接方法在一輪克隆中將表達盒裝配到CRISPR/Cas9雙元載體中。

利用這一系統(tǒng)，研究人員在水稻中編輯了46個靶位點，突變率平均為85.4%，其中大多數(shù)為雙等位基因突變(biallelic mutation)和純合突變。他們推斷在水稻中大約16%的純合突變是通過非同源非同源性末端連接及隨后的同源重組修復產(chǎn)生。在擬南芥T1植物中他們還獲得了均衡的雙等位基因突變、純合突變和嵌合突變。并證實在水稻和擬南芥中的這些定點突變都是可以遺傳的。通過同時靶向一個基因家族的8個成員，一條生物合成信號通路中的多個基因，或是單基因中的多個位點，研究人員提供了一些在T0水稻和T1擬南芥中功能缺失基因突變的示例。

這一新系統(tǒng)為在植物基礎研究中探究多個基因和基因家族的功能以及實現(xiàn)遺傳改良提供了一個通用工具箱。

（生物通：何嬙）

生物通推薦原文摘要：

A robustCRISPR/Cas9 system for convenient, high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicotplants

CRISPR/Cas9 targeting systems have been applied to a variety of species. However, most of current CRISPR/Cas9 systems for plantscan only modify one or a few target sites. Here, we report a robust CRISPR/Cas9 vector system, utilizing a plant codon-optimized Cas9 gene, for convenient and high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicot plants……

作者簡介：

劉耀光

博士，研究員，博士生導師,教育部****特聘教授,廣東省教育廳植物基因組學與生物技術重點實驗室主任,（省部共建）教育部水稻育性發(fā)育與抗逆重點實驗室主任,亞熱帶農業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室副主任

工作經(jīng)歷
1982.3-1984.8  湖南省長沙市農業(yè)�？茖W校，助教
1991.4-1993.3 日本三井植物生物技術研究所，博士后
1993.4-1996.6 日本三井植物生物技術研究所，研究員
1996.7- 現(xiàn)在   華南農業(yè)大學生命科學學院遺傳工程研究室，研究員

學習經(jīng)歷
學位 學歷 學科門類 專業(yè) 畢業(yè)學校 類型 入學時間 畢業(yè)時間
博士 博士研究生 農學 植物遺傳學 日本京都大學 全日制 1988-04 1991-03
碩士 碩士研究生 農學 作物遺傳育種 日本香川大學 全日制 1985-10 1988-03
學士 大學本科 農學 作物遺傳育種 華南農業(yè)大學 全日制 1978-03 1982-02

主要研究領域
植物基因工程、水稻基因的定位與克隆、水稻分子生物學。目前主要研究課題包括水稻細胞質雄性不育基因及其恢復基因的克隆和分子機理、水稻雜種不育基因的克隆和分子機理、水稻生殖發(fā)育的分子調控等。