目前，NGS技術已經越來越多地應用于人類T細胞受體（TCR）多樣性的研究。不過，在利用傳統方法生成TCR測序文庫時，往往只包含TCR可變區的一部分，而且需要用到復雜的多重PCR策略。為此，Takara旗下Clontech近日推出了一個新的解決方案。

SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit為那些利用NGS開展TCR免疫組庫分析的研究人員帶來了一個強大的方案。它以RNA樣本或淋巴細胞作為起始材料，采用類似5’ RACE的策略來捕獲TCR轉錄本中完整的V(D)J可變區。

這個試劑盒接受的RNA起始量很廣泛。有研究表明，從外周血白細胞中獲得的10 ng至3 μg RNA可產生高質量的測序文庫。您甚至可以直接從完整的淋巴細胞開始，用50至10,000個純化的T細胞制備文庫。

顧名思義，這個試劑盒能夠產生TCR-α和TCR-β鏈多樣性的數據，這些可以單獨獲得或同時獲得。與以往的多重PCR方法不同，每一輪的文庫擴增使用一對引物來擴增每個TCR亞基。制備好的文庫已經帶有索引，可立即在Illumina平臺上測序。

SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit利用了Clontech成熟的SMART技術以及Exiqon公司的LNA技術，以無偏向的方式擴增TCR的mRNA序列。首先開展第一鏈cDNA合成，在合成鏈的3’端添加一些非模板的核苷酸。之后，SMART-Seq v4 Oligonucleotide與這些核苷酸退火，并作為模板，在第一鏈cDNA上摻入更多的核苷酸。這也就是模板轉換的步驟。摻入的核苷酸，又稱為“SMART序列”，將作為后續PCR的引物退火位點，保證只有全長的cDNA經過擴增。

之后是兩輪PCR，擴增TCR-α和TCR-β可變區所對應的cDNA序列。第一輪的正向引物與SMART序列互補，而反向引物則有兩個，分別對應TCR-α和TCR-β，若需要分析兩個TCR亞基，則可同時加入。第二輪PCR則以第一輪的產物為模板，利用半巢式引物擴增整個可變區和部分恒定區。在PCR后，經過純化、大小選擇和定量，文庫即可用于測序。

 
圖1. SMARTer 法文庫構建流程及TCR多樣性分析PCR策略

這個試劑盒具有出色的靈敏度和重復性。實驗表明，即使樣品起始量存在差異，它依然能獲得一致的結果。同時，它也實現了低豐度TCR序列的檢測。在免疫組庫分析上，它也可以助您一臂之力。

 
圖2 SMART技術重復性和靈敏度分析。以PBMC RNA樣品中分別摻入不同濃度（10%，1%，0.1%，0.01%和0.001%）的同源白血病Jurkat T細胞RNA（TRAV8-4-TRAJ3，TRBV12-3-TRBJ1-2克隆型）為起始，利用SMARTer技術構建文庫。對每一個混合文庫測序獲得的TRBV12-3-TRBJ1-2相關的讀段數量通過扣除陰性對照（PMBC RNA）的讀段數進行均一化處理。分析表明，SMARTer技術構建的測序文庫對不同豐度的特定TCR克隆型的分析是可信、可重復的（Panel A）。利用SMARTer技術構建文庫，可以對摻入量為0.1%的Jurkat RNA進行有效測序，證明了SMARTer技術的靈敏性（Panel B）。

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