在mRNA的耀眼光芒下，非編碼RNA（ncRNA）一直都是默默無聞的配角。如今，這些ncRNA，包括microRNA（miRNA）和長鏈非編碼RNA（lncRNA）逐漸登上舞臺，贏得科學家的關(guān)注。非編碼RNA有望作為癌癥、自閉癥、阿爾茨海默病等疾病的生物標志物。研究人員也能夠從無創(chuàng)的液體活檢樣本中檢測ncRNA，從而更好地診斷和治療疾病。現(xiàn)在，我們就來看看ncRNA工具方面的一些進展。

分離ncRNA

在ncRNA研究中，研究人員通常純化出總RNA，再利用引物擴增出感興趣的ncRNA。對于這個過程的第一步，許多廠商提供了RNA制備試劑盒。例如，QIAGEN提供了一系列試劑盒，它們的不同之處在于所分離RNA的大小。RNeasy試劑盒可分離100 nt及以上的總RNA，而miRNeasy試劑盒可分離18 nt及以上的總RNA。其他廠商也提供相關(guān)產(chǎn)品，包括Bio-Rad、Clontech、Epicentre、Promega、Thermo Fisher Scientific和Zymo Research。

隨著人們對液體活檢的興趣漸增，QIAGEN也推出了相應(yīng)的解決方案。據(jù)QIAGEN全球產(chǎn)品經(jīng)理Brian Dugan介紹，exoRNeasy主要用于exosomes的純化和富集，然后開展總RNA的分離。這家公司也提供miRNeasy血清/血漿試劑盒，稍作修改可用于生物體液。此外，QIAGEN最近還推出了測序lncRNA（和mRNA）的靶向RNA測序試劑盒。

分離ncRNA也是臨床腫瘤研究人員的目標，他們希望“通過生物標志物讓療法與患者相匹配，從而實現(xiàn)更好的個性化治療，”賽默飛世爾的樣品制備總經(jīng)理Jeffrey Franz談道。“除了檢測癌癥相關(guān)突變，研究人員也希望從RNA中獲得信息，指導二線的藥物治療。”不過，那些研究人員正在尋找更高通量的RNA工具。

ncRNA的新工具

許多總RNA提取試劑盒都享受了離心柱的便利，不過，樣品通量可能成為限制因素。新的分離工具，如賽默飛的MagMAX™ mirVana™ Total RNA Isolation Kit，通過使用磁珠來加快實驗進度。這項操作可手動開展，也能放在自動化流程中，實現(xiàn)每次96個樣品的更高通量。

Brian Brown是西奈山伊坎醫(yī)學院的副教授，他參與了NIH資助的免疫基因組計劃（Immgen）。“Immgen的一個目標是確定整個免疫系統(tǒng)的microRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并讓它成為科學界的公共資源，”Brown說。“我們的分析包括許多稀有的免疫細胞亞群，如NKT細胞和γδT細胞，它們極其罕見，我們分離到的不足1萬個。”

Brown利用QIAGEN的miScript平臺開展miRNA圖譜分析，因為miScript預擴增系統(tǒng)對處理低豐度樣品特別有用。他還利用miScript PCR芯片來分析數(shù)百個miRNA。總體來看，Brown認為QIAGEN的工具很有價值，因為它們是一致的。“miScript平臺是我們工作中不可缺少的一部分，因為有了它，即使不足1萬個細胞也能開展全基因組miRNA分析，”他說。

MilliporeSigma提供的ncRNA工具包括RNA免疫沉淀（RIP）分析，它分離出ncRNA及與之結(jié)合的小伙伴。Magna Nuclear RIP™試劑盒可協(xié)助研究人員分析與染色質(zhì)關(guān)聯(lián)的RNA，如lncRNA或miRNA。而Magna ChIRP®試劑盒則是新的RNA純化染色質(zhì)分離產(chǎn)品（ChIRP），可分離出lncRNA并研究它們在疾病中的調(diào)控作用。

MilliporeSigma的高級產(chǎn)品經(jīng)理Christian Nievera表示，目前研究人員正在使用該公司的工具來研究ncRNA與疾病之間的關(guān)聯(lián)。“miRNA的例子是let-7，它在調(diào)控DICER和c-myc基因表達上發(fā)揮關(guān)鍵作用，是癌癥和心血管疾病的潛在治療靶點，”Nievera說。“同時，ChIRP分析也被用于非編碼RNA及基因調(diào)控的研究，包括lncRNA THRIL如何調(diào)控TNFα的表達。”

了解QIAGEN的ncRNA分離和檢測產(chǎn)品

樣品制備更輕松

一些RNA分析的樣品制備已經(jīng)變得比以往更輕松。例如，賽默飛世爾的Cells-to-CT分析在微孔板的同一個孔中完成細胞裂解、靶向擴增和逆轉(zhuǎn)錄。因此，它的目標客戶是那些開展高通量篩選的制藥公司和研究實驗室。用戶不需要分離ncRNA，而是直接跳到擴增步驟，F(xiàn)ranz說。

Abcam的Firefly Multiplex miRNA分析也是不需要分離或純化RNA，而是直接檢測血液、血漿和血清樣品中的miRNA。“我們能直接定量體液中的miRNA，因為我們使用了一種生物惰性的基質(zhì)，”Abcam的平臺創(chuàng)新總經(jīng)理Dan Pregibon談道。

這個系統(tǒng)利用凝膠棒檢測miRNA，每個棒上帶有特定的條形碼，以及生物標志物的結(jié)合區(qū)。多個凝膠棒與樣品混合，可實現(xiàn)多重檢測，然后在流式細胞儀上讀取。檢測是在96孔板上進行的，每次可檢測每個樣品中多達68個miRNA，這讓Firefly平臺有望用于高通量篩選。研究人員能自定義檢測板，但Abcam提供腫瘤學、免疫學和毒理學方面的產(chǎn)品。

Pregibon及其同事正與研究人員合作，利用Firefly技術(shù)開發(fā)生物標志物特征。這些復雜的早期生物標志物特征通常由10-50個miRNA組成，可用于疾病的早期篩查。Jordan Plieskatt，喬治華盛頓大學的助理研究員，正在利用Firefly平臺來開發(fā)膽管癌（CCA）的miRNA生物標志物特征，這種癌癥往往沒有明顯跡象，但發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)是晚期，無法成功治療。他希望膽管癌的診斷或預后標志物能夠讓醫(yī)生有更多的時間來治療干預。

肝臟損傷是膽管癌的風險因素之一，比如病毒性肝炎，或在Plieskatt的項目中，肝吸蟲Opisthorchis viverrini誘導的損傷。Plieskatt研究了泰國農(nóng)村地區(qū)的一些膽管癌患者，在那里肝吸蟲十分普遍。

他表示，F(xiàn)irefly平臺滿足了他的需求，因為檢測只需要少量（30-50 μl）的體液，如血清或血漿。這大大節(jié)省了患者的寶貴樣本。他還期盼一種無樣本制備的檢測，以提高通量和降低用戶可變性。在他心目中，理想檢測是能夠在泰國農(nóng)村現(xiàn)場開展的檢測，在單個流程中使用各種可獲得的體液。

Abcam正與Plieskatt合作，將Firefly技術(shù)應(yīng)用在纖維卡這種樣本采集系統(tǒng)上。這種卡片類似于新生兒血液篩查的那種，可采集血清和血漿樣本。在運行檢測時，他打孔獲得了7mm的圓片，并將它與Firefly流程無縫整合，用干血斑取代了液體基質(zhì)。

“現(xiàn)在，我有辦法在現(xiàn)場采集樣本，”Plieskatt說。“我也不需要使用冷鏈，因為在不同溫度下，miRNA在這些纖維卡上保持穩(wěn)定。”未來，他希望能在泰國當?shù)蒯t(yī)院開展分析，而不是將樣本帶回馬薩諸塞州。除了干血斑，F(xiàn)irefly平臺也用于其他挑戰(zhàn)性樣本的miRNA分析，包括肝素血漿和FFPE組織。

Plieskatt可能對Fifefly技術(shù)所做的唯一改進是“在一些關(guān)鍵miRNA的水凝膠顆粒上添加比色標簽，這樣我們就能立即讀取結(jié)果，”他說。“通過這種方式，我們能夠在現(xiàn)場進行初步檢測，并在必要時開展更深入的分析。”

總的來說，有了今天的RNA工具，科學家能夠借助組學的力量來揭開錯綜復雜的ncRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，更深入地了解各種疾病及其調(diào)控，比如免疫系統(tǒng)與癌癥是如何相互作用的。

（作者：Caitlin Smith / 生物通編譯）