過去曾被認為是基因組的"暗物質"的長片段非編碼RNA (lncRNAs)，已被發現在各種生物過程中發揮關鍵作用。LncRNA ANRIL位于一個冠狀動脈疾病和II型糖尿病的遺傳易感位點。研究人員通過在體內和體外分別檢測LncRNA ANRIL對血管內皮生長因子（VEGF） 的調節作用，從而探究ANRIL 在糖尿病引起的視網膜病變中所扮演的角色。

研究背景
糖尿病引起的視網膜病變是50歲以上的個體中最常見的致盲原因，影響三分之一的糖尿病患者。它是一種慢性血管并發癥，其特征為低度炎癥，血清通過微血管滲漏，血管通透性增加，最終導致新生血管形成和形態改變。雖然在過去的十年中，早期診斷和預防方面已經取得了一定進展，然而，在這種并發癥導致視網膜中的功能和結構改變仍然是一個重大的挑戰。內皮細胞（EC）是高血糖損傷的主要目標，在高血糖狀態下經歷滲透性增加，重塑和表型改變，這個過程中有各種血管活性因子參與血管生成。然而，在內皮細胞中的VEGF信號傳導代表了該過程中的一個主要限速步驟：響應提高的氧化應激的誘導，VEGF結合并激活酪氨酸激酶受體VEGFR-1和VEGFR-2。由于VEGF的產生可以在轉錄和轉錄后水平上受到調節，這可能成為一種治療思路的切入點。

哺乳動物系統中的轉錄調節的關鍵特征在于：染色質響應細胞外和內在信號，在“活性”和“非活性”狀態之間的動態轉換。這些信號包括作為主要表觀遺傳學介質的組蛋白和DNA修飾，還有新增的多種RNA分子：包括miRNA和長片段非編碼RNA（lncRNA）。新一代測序技術引發的DNA / RNA測序技術的進展，已明確了許多非編碼RNA （ncRNA）分子具有影響生理和疾病的重要調節作用。lncRNAs已被證明在各種生物過程如轉錄，翻譯，剪接和細胞內/細胞外運輸呈遞中具有重要性。并且，非編碼基因組也受突變的影響。lncRNAs中的突變與諸如癌癥，神經變性疾病和遺傳疾病等疾病相關。

lncRNA ANRIL（INK4基因座的反義RNA）最初從家族性黑色素瘤患者中鑒定出來的，已經成為心血管疾病的潛在靶點。已知它與糖尿病，開角型青光眼和各種癌癥有關。ANRIL由19個外顯子組成，跨越126.3kb并產生3.8bp的RNA。它位于p15/CDKN2B-p16/CDKN2A-p14/ARF基因簇中。ANRIL的過表達也已經證實可調節組蛋白乙酰化因子p300。有報告指它在特定miRNA的表觀遺傳沉默中也發揮作用。

研究思路
這項研究的主要目的是確定由葡萄糖誘導的lncRNA的改變，以及其介導的糖尿病視網膜病變發病機制中的基因轉錄的改變。內皮細胞是葡萄糖誘導的損傷的主要目標，血管內皮生長因子是受ANRIL調節的下游分子。因此，使用HREC研究ANRIL表達中的改變及其對VEGF表達和功能的影響。

Western大學的研究人員對人類視網膜內皮細胞（HRECs）進行高糖培養以模擬糖尿病狀態，然后用siRNA干擾“敲除”這些視網膜內皮細胞（HRECs）中ANRIL的表達，并與不用siRNA干擾的對照進行比較。另外還對ANRIL基因敲除小鼠進行鏈脲霉素誘導糖尿病，與不誘導的ANRIL敲除小鼠對照進行比較。

研究人員分別測量細胞和組織中的VEGF mRNA和蛋白質表達，并通過對血管形成，細胞增殖和視網膜血管滲透性測定來確定各種條件下VEGF功能的改變。通過PRC2阻斷劑，siRNA和RNA免疫沉淀（RNA-IP）分析等方法，作者證實了ANRIL與PRC2（polycomb repressive complex 2）組分和p300的相互作用介導的對血管內皮生長因子的調節。

方法和結果
1.葡萄糖水平可調節ANRIL表達
使用5mM d-葡萄糖（NG）葡萄糖水平作為對照，將人視網膜內皮細胞暴露于25mM d-葡萄糖（高糖）環境，在不同時間點檢測。結果觀察到高糖誘導VEGF表達的升高呈現出時間依賴性方式，在48小時時具有最高表達，對HREC進行的微陣列分析顯示ANRIL升高2.5倍。結果通過實時RT-PCR驗證。然而，在25mM 1-葡萄糖（左旋葡糖，滲透控制）孵育后沒有觀察到顯著的ANRIL改變。文章采用ArrayStar的定制芯片服務，能很方便地檢測lncRNA的變化。免費索取康成生物ArrayStar lncRNA芯片的臨床研究成果案例

對ANRIL進行RNA FISH以檢查其細胞分布并檢測其亞細胞定位。使用由34個互補寡核苷酸組成的定制設計的RNA FISH探針（Biosearch Stellaris FISH定制探針），每個20個堿基長并用3'末端熒光標記物標記。這種方法已被證明對RNA檢測具有高度特異性。通過熒光原位雜交技術證實了葡萄糖誘導的ANRIL表達上調，但其亞細胞分布沒有發現變化。原位熒光雜交顯示ANRIL主要定位在核包膜的胞質側周圍。有趣的是，這有別于此前報告顯示ANRIL在胃癌中呈核表達。lncRNA在不同細胞中的表達模式存在差異性，特別是定位差異，其原因是什么？還不得而知。

2.ANRIL對葡萄糖誘導的VEGF的表達和功能有調控作用

ANRIL已知能夠與PRC2復合物相互作用，而PRC2復合物調節VEGF表達。通過在HREC中使用siRNA敲低ANRIL水平，可探究ANRIL在VEGF調節中的作用。VEGF在mRNA和蛋白水平上調是內皮細胞暴露于高水平葡萄糖的特征之一。這種上調在ANRIL siRNA轉染后被阻斷，從而顯示出二者之間有直接的調節關系。研究人員還用內皮細胞血管生成分析檢測了VEGF介導的血管生成作用，通過沉默ANRIL可阻斷由葡萄糖誘導的血管形成增加，這種阻斷又可以通過與VEGF孵育來逆轉。 WST-1測定進一步表明，與對照相比，siANRIL轉染的細胞中細胞增殖受到抑制。同樣的，VEGF孵育可提高siANRIL轉染的細胞在低糖和高糖培養基中的細胞增殖能力。

3.在ANRILKO小鼠中，糖尿病引起的癥狀被阻斷，視網膜VEGF表達上調也被阻斷
研究人員還使用ANRILKO小鼠模型（ANRIL敲除小鼠模型）。用STZ誘導野生型和ANRIL敲除小鼠的糖尿病。野生型糖尿病小鼠表現出高血糖癥，多尿，糖尿和減少體重增加，而STZ誘導的ANRIL敲除小鼠的這些參數除了尿量之外都沒有受到影響。研究人員檢查了來自糖尿病和對照動物的視網膜組織，并分析ANRIL和VEGF表達。在野生型糖尿病動物的視網膜中觀察到ANRIL上調，VEGF mRNA和蛋白水平升高；而在ANRILKO糖尿病小鼠中所有這些變化都沒有發生！

外滲的IgG是增加通透性——也就是VEGF的功能性作用的標志物。高血糖在野生型糖尿病小鼠中引起的視網膜微血管通透性增加（評分3，與野生型對照中的評分0相比），而糖尿病ANRILKO小鼠（評分1）。這些觀察表明ANRIL具有調節VEGF表達、在糖尿病性視網膜病變中的發揮作用。

4.ANRIL通過PRC復合物導致VEGF上調
有研究表明葡萄糖誘導的VEGF上調是通過PRC2復合物發揮作用的。PRC2是轉錄抑制復合物PRCs（PRC1和PRC2）的一部分，并且由許多亞基（例如EZH2，EED，SUZ12和RpAp46/48）。這些復合物在CDKN2A/B基因位點的表觀遺傳調控中至關重要。那么，ANRIL與糖尿病視網膜病變中的PRC2復合物有沒有什么關系呢？實驗結果表明，在暴露于高糖的HREC中、在糖尿病動物的視網膜中檢測到EZH2的表達上調。而ANRILKO敲除小鼠導致EZH2水平的顯著下調。EED表達水平類似地改變，而SUZ12水平保持不受影響。為了確定因果關系，研究人員還使用廣譜甲基化酶阻斷劑DZNEP來抑制PRC2活性。 PRC2復合物的所有組分被該甲基化酶阻斷劑抑制。這種阻斷導致VEGF和ANRIL的mRNA表達水平降低，表明PRC2對ANRIL和VEGF也具有調節作用。

5.ANRIL通過p300和miR200b起作用
早前的研究表明，VEGF通過p300也受miR200b的調節。有趣的是，研究人員發現使用siRNA干擾ANRIL表達而導致由葡萄糖誘導的p300上調得到修正。相比對照和糖尿病小鼠的視網膜組織，ANRILKO敲除小鼠也顯著降低p300的表達。這些研究結果表明ANRIL能夠調節糖尿病視網膜病變中由葡萄糖介導的p300增加。

那么p300對ANRIL有沒有反饋調節呢？通過在HREC中沉默p300（這種沉默導致p300 mRNA表達減少約75％），可觀察到該改變對ANRIL表達沒有影響。 另一方面，ANRIL沉默也減少了葡萄糖誘導的miR200b下調。通過對HREC的RNA-IP分析（RNA免疫沉淀采用Millipore的Magna RIP RNA結合免疫沉淀試劑盒），進一步確認ANRIL與PRC2和p300的EZH2組分存在相互作用。 由針對EZH2和p300的特異性抗體進行免疫沉淀的樣品，采用實時RT-PCR可測定ANRIL表達水平。當暴露于高葡萄糖水平時，ANRIL與p300的結合顯著升高。 在高糖條件下EZH2與ANRIL的結合也增加。這些數據表明當暴露于高水平的葡萄糖時ANRIL直接結合p300和EZH2二者。

結論：高糖和糖尿病導致在HREC和視網膜中的ANRIL上調。利用siRNA來沉默由葡萄糖介導的ANRIL升高，可阻止VEGF表達。這種調節涉及ANRIL介導的對PRC2組分p300和miR200b的調控。在暴露于高濃度葡萄糖后，ANRIL與p300和EZH2(enhancer of zeste homolog 2, PRC2組分）的直接結合水平升高。

討論

當前對增殖性糖尿病性視網膜病變的治療通常是圍繞激光光凝術、玻璃體-視網膜手術治療。靶向轉錄過程將可能成為一種新的方法。ANRIL敲除小鼠就表現出幾乎不受糖尿病癥狀影響。

雖然以前沒有關于糖尿病視網膜病變ANRIL改變的報道，但最近有報告另一種lncRNA心肌梗死相關轉錄物（MIAT）在糖尿病視網膜病變中呈現出上調。在基因組中ANRIL上調的確切途徑仍不清楚。長ncRNA也和編碼基因一樣受相同的調節過程。因此，高血糖誘導的氧化應激和隨后的轉錄機制的改變也可能潛在地調節這種過程。

最后作者得出結論，在視網膜內皮細胞中，葡萄糖引起ANRIL的上調，并改變了VEGF表達和功能。ANRIL對VEGF的調節作用由ANRIL與PRC2復合物的組分和組蛋白乙酰化劑p300的相互作用介導的。這項研究的當前數據揭示了一種潛在的、有針對性的新方法，可用基于RNA的方法預防糖尿病視網膜病變。這篇文章對lncRNA研究線路清晰完整，值得一看。