研究背景

肝癌細胞（HCC）經常侵入門靜脈系統并且發展成為門靜脈腫瘤血栓（PVTT）。長臉非編碼RNA是一類不能夠編碼蛋白質，并且長度大于200bp的具有生物學功能的RNA。有研究報道，其對肝癌發生具有重要影響。但是其具體的關聯卻并還沒有詳細的研究。在此，清華大學聯合上海東方肝膽醫院研究人員通過對20個病人的60個臨床樣本進行RNA-Seq鑒定到了8603個可能的lncRNA。其中917個lncRNA在TCGA數據庫以及發表的肝癌數據庫中有關聯，235個lncRNA存在CNVs和DNA甲基化變化。很多與lncRNA共表達的基因富集在細胞粘著、免疫反應以及代謝過程等通路上。HAND2-AS1還通過RNAi的敲降進行了部分功能研究。因此，可以說研究人員對lncRNA在肝癌的腫瘤發生與轉移過程中提供了有用的資源。

研究思路

 
研究結果

鑒定臨床樣本中肝癌細胞的lncRNA

為了系統鑒定肝癌發生與轉移細胞中的lncRNA，研究人員收集了20個臨床病人的60歌樣本進行了全轉錄組的RNA測序(該服務由伯豪生物提供)。其中，每個病人分別收集原發灶、臨近的正常組織以及PVTT樣本。一共鑒定到了20345個蛋白編碼基因，13870個GencodeV19鑒定的lncRNA以及8603個新的lncRNA。分析流程如圖1。

 
圖1: 數據分析流程。

候選lncRNA的鑒定

對這些新的lncRNA在基因組位置、表達豐度、轉錄本長度、保守性以及SNP分析發現，74%的lncRNA定位于基因間區域，16%為反向lncRNA，只有3%定位于基因內含子區域。新的lncRNA在轉錄本長度上比蛋白編碼基因要短一些，卻長于GENCODE的lncRNA。從保守性來講，新的lncRNA保守性更差，相比較而言，外顯子區域的保守性要強于內含子區域（圖2）。

 
圖2: 新lncRNA的鑒定。

腫瘤與PVTT中的lncRNA

研究人員使用統計學的方法對腫瘤與PVTT的lncRNA表達模式進行了統計。結果發現，原發灶的lncRNA和正常組織相比表達量遠比轉移組織lncRNA的差異大得多（圖3）。

 
圖3: 腫瘤與PVTT中的lncRNA表達分析

lncRNA與公共臨床數據庫的分析

通過將lncRNA測序數據與Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) 數據庫的數據比對后發現，測序的數據與公共數據庫中的數據具有較好的一致性（圖4）。

 
圖4：lncRNA與公共臨床數據庫的比對。

鑒于此，研究人員認為lncRNA可能可以作為腫瘤的生物標志物用于臨床診斷。因此，研究人員篩選了其中一個lncRNA RP11-166D19.1并且應用于臨床的生存率研究。結果發現，該lncRNA高表達的情況下，臨床病人生存率顯著升高。

 
圖5：RP11-166D19.1作為生物標志物的研究。

lncRNA的CNVs與DNA甲基化研究

研究人員對lncRNA還進行了CNVs以及甲基化的研究（圖6）。對于CNVs的研究，研究人員使用了Affymetrix CytoscanHD芯片(該服務由伯豪生物提供)。給予GISTIC的分析，4個染色體位點顯著擴增，70個染色體位點顯著缺失（圖6）。在這些染色體區段中，染色體位點顯著缺失的區段中存在147個lncRNA，而染色體位點顯著擴增的區段中則沒有lncRNA存在。

此外，研究人員還使用了DNA甲基化芯片（Illumina Infinium HumanMethylation 450 k服務由伯豪生物提供）對60個樣本進行了甲基化檢測。結果發現，93個lncRNA的表達和甲基化之間存在關聯（圖6）。其中，HAND2-AS1的啟動子區域在腫瘤細胞中存在超甲基化情況（圖6）。

 
圖6: lncRNA的CNVs與DNA甲基化研究

lncRNA共表達網絡構建

為了預測lncRNA的功能與調控機制，研究人員構建了lncRNA與其互作的蛋白編碼基因的調控網絡圖（圖7）。在預測到的43個網絡簇中，有4個簇中腫瘤相關的lncRNA顯著富集（圖7）。其中，第25個簇中的蛋白編碼基因包括了和腫瘤轉移相關的細胞粘著以及TGF-b通路。并且，很多肝癌驅動基因也富集在了這個網絡中（圖7）。

 
圖7: lncRNA共表達網絡構建。

腫瘤轉移相關的lncRNA功能研究

為了研究單個lncRNA對肝癌的調控關系，研究人員挑選了10個在之前研究中認為和肝癌相關的lncRNA，并對其進行了RNAi沉默（圖8）。結果發現，RP11-166D19.1，HAND2-AS1以及XLOC_015969的RNAi細胞系均表現出了不同的對腫瘤細胞的影響（圖8）。

圖8: 腫瘤轉移相關的lncRNA功能研究

小結

長久以來，腫瘤的生物標志物一直都是較多的局限于對蛋白編碼的基因的檢測。而在本工作中，研究人員通過對肝癌細胞的lncRNA轉錄組測序與CNVs以及甲基化檢測，確認了在肝癌細胞中新的lncRNA同樣具有生物標志物的潛在臨床價值。

原文出處：
Yang Y, Chen L, Gu J,et al. Recurrently deregulated lncRNAs in hepatocellular
Carcinoma. Nat Commun.2017.