唐家澍  賽默飛世爾科技（中國）有限公司
 
非靶向蛋白質(zhì)組學(xué)中有多種定量方法用于研究蛋白質(zhì)表達以及翻譯后修飾的調(diào)控，總體來說分為三類: 非標(biāo)記定量（label free），體內(nèi)代謝標(biāo)記和體外化學(xué)標(biāo)記。穩(wěn)定同位素氨基酸培養(yǎng)摻入標(biāo)記（Stable Isotope Labeling by Amino acid in Cell culture, SILAC）是使用最為廣泛的一種體內(nèi)代謝標(biāo)記方法[1]，除了能都實現(xiàn)對細胞系樣品實的定量研究外，SILAC方法還可以用于組織樣品的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究。通過使用合適的SILAC標(biāo)記的細胞系樣品作為內(nèi)標(biāo)，我們可以對組織樣本的全蛋白質(zhì)組[2]，乃至翻譯后修飾[3]進行系統(tǒng)的定量研究。

磷酸化信號級聯(lián)是生物體信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵分子機制，因此磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究一直是生物學(xué)研究的熱點之一。磷酸化修飾在體內(nèi)的豐度很低，因此需要對磷酸化肽段進行富集才能夠通過質(zhì)譜分析得到較好的鑒定結(jié)果。磷酸化肽段的富集方法主要包括固定化金屬親和色譜（Immobilized Metal Affinity Chromatography，IMAC）[4]，二氧化鈦（Titanium dioxide, TiO2）[5]以及基于抗體的富集方法[6]。受到蛋白質(zhì)起始量的限制，在小量組織中進行磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的分析難度較大。在這篇工作中，我們采用適合小量組織的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程，結(jié)合內(nèi)標(biāo)摻入 SILAC 的定量方法對大鼠胰島進行了蛋白質(zhì)組以及磷酸化蛋白質(zhì)組的定量研究。

實驗方法
1. 樣品處理
INS-1E細胞采用SILAC培養(yǎng)基培養(yǎng)，其中摻入L-[13C6，15N2]-lysine（Lys8），L-[13C6，15N4]-arginine • HCl（Arg10）和普通脯氨酸（L-proline）。胰島分離自6周雄性Wistar大鼠，具體步驟參考文獻[7]。實驗設(shè)計和工作流程見圖1。

2. 色譜條件
高效液相色譜儀： Easy nLC 1200（ThermoFisher Scientific）分析柱：自制 C18納升級噴針柱，長度20 cm，內(nèi)徑 75 µm，粒徑3 µm
流動相：A，0.1% 甲酸/水；B，0.1% 甲酸/80% 乙腈
梯度：0-2 min，4-8% B；2-125 min，8-28% B；
125-140 min，28-40% B；140-142 min，40-99% B；
142-150 min，99%B
流速：300 nL/min

3. 質(zhì)譜采集方法
質(zhì)譜儀：Orbitrap Fusion Lumos（ThermoFisher Scientific）離子源：NanoFlex；離子模式：正離子；噴霧電壓：1.9 Kv；離子傳輸管溫度：300度；S-lens RF：30%
分辨率：一級120 K，二級15 K；AGC：一級4e5，二級5e4；MaxIT：一級20 ms，二級100 ms；
碰撞能量：32%

圖1. 實驗設(shè)計和工作流程（A、內(nèi)標(biāo)摻入SILAC法用于大鼠胰島蛋白質(zhì)組及磷酸化蛋白質(zhì)組定量的實驗設(shè)計；B、基于StageTip的自制TiO2萃取小柱用于小量樣品磷酸化肽段富集的工作流程）

實驗結(jié)果
1. 內(nèi)標(biāo)摻入SILAC法用于大鼠胰島蛋白質(zhì)組及磷酸化蛋白質(zhì)組定量研究
INS-1E細胞系是一種大鼠胰島β細胞系，我們將其培養(yǎng)基中的lysine和arginine替換為L-[13C6，15N2]-lysine（Lys8），L-[13C6，15N4]-arginine • HCl 來進行 SILAC 標(biāo)記。在標(biāo)記完全后，我們將重標(biāo)細胞的全蛋白作為內(nèi)標(biāo)和大鼠胰島全蛋白裂解液 1:1 混合，隨后進行FASP酶解，胰蛋白酶酶解后的肽段隨后進行TiO2 的富集。TiO2 萃取小柱的流穿組分含磷酸化肽段較少，這部分肽段經(jīng)過脫鹽后進行 LC-MS/MS 分析用于全蛋白質(zhì)組的定量研究。而 TiO2 的洗脫組分富含磷酸化肽段，這部分肽段用于磷酸化蛋白質(zhì)組的定量研究（圖 1A）。

圖 2. 基于 StageTip 的自制 TiO2 萃取小柱制作流程（A、采用 C8 反向填料膜片制作 C8 StageTip 小柱，此圖片來自文獻[8]；B、在 C8 小柱上加入適量的 TiO2 beads 用于富集磷酸化肽段。使用頂端挖孔的 1.5 mL Ep 管作為 TiO2 萃取小柱的離心裝置，此配置能保證加入 200 µL 流動相后，TiO2 萃取小柱不會離心離干）

2. 基于 StageTip 的自制 TiO2 萃取小柱用于小量樣品磷酸化肽段富集
胰島是一個較為典型的小量組織，一只 6 周左右的雄性大鼠一般能得到 30-50 µg 的胰島蛋白質(zhì)。之前的文獻報道在使用 TiO2 beads 進行磷酸化肽段富集時，蛋白樣品和 TiO2 beads 的比例對磷酸化肽段的富集效率有較大影響[9]。為了更靈活的控制 TiO2 beads 的使用量，我們采用了自制的基于 StageTip 的 TiO2 萃取小柱來進行胰島樣品磷酸化肽段的富集（圖 2）。我們發(fā)現(xiàn)1:1（蛋白質(zhì)：TiO2 beads 質(zhì)量比）的比例對于胰島樣品來說可以得到最優(yōu)的磷酸化肽段富集效果（數(shù)據(jù)未展示）。同時我們還發(fā)現(xiàn)對胰島樣品進行一次富集并不足以富集完所有磷酸化肽段（圖 3B、C），因此采取了 2 次富集的策略，通過磷酸化肽段對 TiO2 beads 的親和能力的不同來對磷酸化肽段進行初步的預(yù)分級，兩次富集的磷酸化肽段分別進行質(zhì)譜分析得到磷酸化蛋白質(zhì)組的定量結(jié)果。而第二次富集的流穿組分已基本不含有磷酸化肽段，經(jīng)過脫鹽后這部分肽段則用于全蛋白質(zhì)組的定量研究（圖 1B）。

由圖 3A 可見，30 µg的胰島蛋白質(zhì)經(jīng)過 TiO2 富集后能得到的磷酸化肽段還是很少，兩只大鼠共四個質(zhì)譜 Raw 文件一共鑒定到了 3,523 個磷酸化肽段（圖 3B、C），對應(yīng) 3,930 個磷酸化位點，其中 2,920 個磷酸化位點可以準(zhǔn)確定位（MaxQuant PTM score 系統(tǒng)一類位點，定位概率 > 0.75）（圖 3D、3G）。第二次的 TiO2 小柱富集也能達到 80% 以上的磷酸化肽段富集效率（圖 3B），帶來 10% 的新增位點的鑒定（圖 3C）。從母離子質(zhì)量偏差和二級譜圖搜索引擎打分分布上可見磷酸化肽段的鑒定質(zhì)量較高（圖 3E、3F）。

 
圖 3. 自制 TiO2 萃取小柱富集胰島樣品的磷酸化肽段（A、胰島樣品富集2次后得到的磷酸化肽段分別進行 LC-MSMS 分析，圖中所展示為 MS1 的 TIC 譜圖；B、兩只大鼠的磷酸化肽段鑒定結(jié)果；C、胰島樣品富集 2 次后得到的每個組分的磷酸化肽段的重合情況；D、絲，蘇，酪氨酸磷酸化位點分布統(tǒng)計，這里僅統(tǒng)計了一類位點；E、所有鑒定的肽段的質(zhì)譜測量質(zhì)量偏差分布；F、所有鑒定的磷酸化肽段的搜索引擎（Andromeda）打分分布；G、所有鑒定的磷酸化位點的定位概率分布）

3. 對 SILAC 內(nèi)標(biāo)（重同位素氨基酸標(biāo)記的 INS-1E 細胞）的評價
內(nèi)標(biāo)細胞的 SILAC 標(biāo)記質(zhì)量直接決定了定量蛋白質(zhì)組學(xué)實驗的結(jié)果。在進行 SILAC 標(biāo)記實驗時，我們必須考慮一個問題：在標(biāo)記過程中同位素氨基酸的相互代謝轉(zhuǎn)化可能會對定量帶來影響。精氨酸（arginine）是脯氨酸（proline）生物合成的一個代謝前體（圖 4B），已有多篇采用 SILAC定量策略的文獻報道重同位素標(biāo)記的精氨酸可通過代謝轉(zhuǎn)化導(dǎo)致細胞內(nèi)的脯氨酸也被重同位素標(biāo)記[10]。這種精氨酸-脯氨酸轉(zhuǎn)變的存在使得含有脯氨酸殘基的“重”標(biāo)肽段的強度下降，從而大大影響定量的準(zhǔn)確性。除了降低定量的準(zhǔn)確性之外，氨基酸轉(zhuǎn)化還導(dǎo)致了譜圖復(fù)雜性的增加，從而降低肽段的鑒定和定量效率[11]。圖 4A 展示一條含有四個脯氨酸殘基的肽段，可見 L-[13C6，15N4]-arginine標(biāo)記后不僅有正常的 R10 的質(zhì)譜峰，還出現(xiàn)了多個脯氨酸轉(zhuǎn)化（R10P6）的質(zhì)譜峰。通過降低 SILAC 培養(yǎng)基中L-[13C6，15N4]-arginine 的量并不足以完全消除這種精氨酸-脯氨酸的轉(zhuǎn)化（圖 4A），我們隨后又在 SILAC 培養(yǎng)基中加入了 10 倍量的非標(biāo)記脯氨酸，此時即可完全消除精氨酸脯氨酸轉(zhuǎn)化（圖 4A）。判斷精氨酸脯氨酸轉(zhuǎn)化是否存最為簡便的方法為將含有脯氨酸與不含有脯氨酸的肽段分別繪制重/輕肽段的定量分布曲線，若兩者完全重合即說明樣品中的脯氨酸未被重標(biāo)（圖 4C）。當(dāng)然，對 SILAC 培養(yǎng)基中的成分比例進行調(diào)整后可能會影響細胞的標(biāo)記效率，但一般來說通過增加標(biāo)記時間便可以克服（圖 4D）。

圖4. 調(diào)整 SILAC 培養(yǎng)基的成分比例消除精氨酸-脯氨酸轉(zhuǎn)化（A、舉例，含有 4 個脯氨酸的一條肽段的一級質(zhì)譜；B、哺乳動物細胞中精氨酸、脯氨酸相互轉(zhuǎn)化的代謝通路；C、含有脯氨酸與不含有脯氨酸的肽段的定量分布曲線；D、不同 SILAC 培養(yǎng)條件下 INS-1E 細胞的標(biāo)記效率）

4. 大鼠胰島的全蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組定量結(jié)果
MaxQuant 軟件在進行 SILAC 定量時會進行數(shù)據(jù)質(zhì)量的評估。首先 MaxQuant 會進行去同位素峰處理，得到每張一級譜的輕，重肽段的強度，隨后包含輕重肽段的多張一級譜會進行共洗脫的判定，若輕重肽段的共洗脫相關(guān)性大于 0.5，MaxQuant 則認為這二者為 SILAC pair，從而通過線性回歸計算重標(biāo)肽/輕標(biāo)肽的定量比值（圖 5A）[12]。通過一次 Shotgun 的質(zhì)譜分析，我們能夠鑒定到 3,856 個大鼠胰島蛋白質(zhì)，其中 70% 可以通過重標(biāo)的INS-1E細胞作為內(nèi)標(biāo)來定量（圖 5B，MaxQuant 在蛋白質(zhì)定量時要求每個蛋白質(zhì)至少含有兩條定量肽段）。而在磷酸化方面，一次 Shotgun 的質(zhì)譜分析可以鑒定到 2,761 胰島磷酸化位點，其中 85% 可以得到定量信息（圖 5B）。在進行 SILAC 定量時，由于受到質(zhì)譜定量動態(tài)范圍的限制，過于極端的定量比值往往可信度較低。INS-1E 細胞作為內(nèi)標(biāo)時，除了能很高程度的覆蓋胰島蛋白質(zhì)組并進行定量外，其定量比值也較為均一，約 98% 以上的蛋白質(zhì)和磷酸化位點其定量值在 16 倍以內(nèi)（圖 5C），保證了采用 INS-1E 作為內(nèi)標(biāo)來對胰島蛋白質(zhì)組進行定量是可靠的。

圖 5. 大鼠胰島的全蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組 SILAC 定量結(jié)果（A、MaxQuant 進行 SILAC 定量時的工作流程；B、大鼠胰島的全蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組鑒定，定量結(jié)果統(tǒng)計；C、大鼠胰島的全蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組定量分布曲線）

討論
在這篇工作中，我們采用內(nèi)標(biāo)摻入 SILAC 的定量方法對大鼠胰島進行了蛋白質(zhì)組以及磷酸化蛋白質(zhì)組的定量研究。通過對 SILAC 培養(yǎng)基的成分比例調(diào)整，我們優(yōu)化了 INS-1E 細胞的標(biāo)記方法。胰島內(nèi)包含多種細胞類型，如α細胞，β細胞，δ細胞等，我們發(fā)現(xiàn)采用 INS-1E 細胞系（一種β細胞系）已經(jīng)可以較好的覆蓋胰島的全蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組。若關(guān)心胰島中的α細胞的話，則可以標(biāo)記α細胞系來作為內(nèi)標(biāo)摻入胰島。此外，我們還可以采用多種細胞系作為內(nèi)標(biāo)，這種稱為“Super SILAC”的方法來完成對復(fù)雜組織蛋白質(zhì)的全覆蓋[2]。
在磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)流程中，我們采用了自制的基于StageTip 的TiO2萃取小柱來靈活的實現(xiàn)小量樣品的磷酸化肽段富集。樣品量始終是磷酸化以及其他一些翻譯后修飾研究繞不過去的話題，一般來說只有增加樣品量，并采取適當(dāng)?shù)念A(yù)分級手段才能更深度的去覆蓋這些翻譯后修飾蛋白質(zhì)組。ThermoFisher 也提供了商業(yè)化的 IMAC 試劑盒（Cat # 88300），鑒于 IMAC 和 TiO2 對磷酸化肽段富集有著較好的互補性，這兩者聯(lián)用會對磷酸化蛋白質(zhì)組的深度覆蓋達到更好的效果。

參考文獻
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