DNA芯片（上圖左側(cè)）由附著在表面的核酸探針組成。首先，從樣品中提取RNA并轉(zhuǎn)化為互補(bǔ)DNA（cDNA），用熒光標(biāo)簽（1）進(jìn)行標(biāo)記。 接下來標(biāo)記的cDNA片段與芯片（2）上的核酸雜交。 掃描芯片檢測每個斑點(diǎn)的熒光水平，從而得到基因表達(dá)水平（3）。 在RNA-seq中，RNA也從樣品中提取并轉(zhuǎn)化為cDNA，以備用于測序（A）。 接下來對cDNA文庫進(jìn)行測序（B），將所得讀數(shù)與基因組對應(yīng)，定量分析基因表達(dá)（C）。

生物通報(bào)道：自二十世紀(jì)九十年代中期以來，芯片就一直是基因組表達(dá)分析的中堅(jiān)力量。在這一技術(shù)最輝煌的時期，準(zhǔn)備研究基因表達(dá)模式的人都會想到使用芯片。不過隨著測序成本的直線下降，RNA測序（RNA-seq）成為了越來越受歡迎的轉(zhuǎn)錄組分析方法。

DNA芯片上排列著大量的核酸探針，可以代表生物的整個基因組或部分基因組，比如外顯子、miRNA、單核苷酸多態(tài)性SNP等等。用芯片分析基因表達(dá)需要抽提RNA，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行熒光標(biāo)記。芯片上各點(diǎn)的信號強(qiáng)弱，代表了該探針目的基因的表達(dá)量。

RNA-seq主要是將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA文庫，然后進(jìn)行直接測序。雖然處理原始數(shù)據(jù)比較麻煩，但RNA-seq能夠做得到芯片做不到的事。RNA-seq可以揭示未知的轉(zhuǎn)錄本、基因融合和遺傳多態(tài)性，而芯片只能檢出明確的已知目標(biāo)。在測序深度足夠的情況下，RNA-seq在高豐度和低豐度轉(zhuǎn)錄本檢測中都比芯片有效。

不過由于芯片可以快速分析大量樣本，該技術(shù)在這方面還將繼續(xù)占據(jù)統(tǒng)治地位，F(xiàn)DA國家毒理學(xué)研究中心的Weida Tong指出。不過，科學(xué)研究最終將完全轉(zhuǎn)向RNA-seq，Tong說。在此之前，芯片和RNA-seq數(shù)據(jù)應(yīng)當(dāng)更加兼容，RNA-seq數(shù)據(jù)的分析和儲存必須進(jìn)一步簡化。“這就像是臨產(chǎn)前的陣痛期，”Tong說�！耙坏┩瓿蛇@個痛苦的過程，大家就能真正享受到技術(shù)帶來的福利。”

The Scientist雜志與多位專家共同探討了從芯片到RNA-seq的過渡，希望幫助研究者們順利度過這段艱難的轉(zhuǎn)型期，最終實(shí)現(xiàn)華麗轉(zhuǎn)身。

通向全新世界

芯片分析依賴于已知的基因組信息，這也是該技術(shù)的最大局限。顯然，在探索性研究和非模式生物研究中，RNA-seq才是真正的大贏家。RNA-seq的轉(zhuǎn)錄組分析是無偏好的，可以揭示新剪接點(diǎn)、小RNA以及芯片漏掉的新基因。

“與芯片探針不同，RNA測序不需要預(yù)先知道序列信息，”安捷倫科技公司的Kevin Poon說，“因此它是一個理想的研發(fā)平臺，能夠獲得轉(zhuǎn)錄本序列并在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)突變和融合轉(zhuǎn)錄本�！�

改用RNA-seq的研究者們往往是“看到了芯片無法檢出的生物學(xué)信息，”賽默飛世爾公司的Anup Parikh指出。舉例來說，南佛羅里達(dá)大學(xué)（USF）Christina Richards實(shí)驗(yàn)室的研究生Mariano Alvarez正在研究2010墨西哥灣漏油事件對當(dāng)?shù)刂参锏挠绊�。他們最初是用芯片在評估基因表達(dá)，但現(xiàn)在他們已經(jīng)引入了RNA測序數(shù)據(jù)，以獲得更為豐富的信息。

沒有底線的檢測

芯片檢測的動態(tài)范圍比較窄，在轉(zhuǎn)錄本豐度很低的情況下，RNA-seq才是你正確的選擇。Tong及其同事去年用Illumina RNA-seq平臺和Affymetrix芯片，評估了大鼠肝臟在藥物處理下的基因表達(dá)改變。他們發(fā)現(xiàn)，在檢測豐度較高的基因時，RNA-seq和芯片的結(jié)果基本一致。但在檢測表達(dá)水平低的基因時，RNA-seq更加準(zhǔn)確。這一結(jié)論也得到了其他一些研究的支持。

造成這種差異的主要原因是，當(dāng)基因低水平表達(dá)時，芯片中結(jié)合探針的cDNA發(fā)出較弱的熒光，難以壓倒背景熒光。對于RNA-seq而言，覆蓋度越高能檢測的轉(zhuǎn)錄本水平就越低，沒有絕對的下限。當(dāng)然，RNA-seq也沒有絕對的檢測上限。而芯片在檢測表達(dá)量很高的基因時，可能會出現(xiàn)飽和。（延伸閱讀：亂花漸欲迷人眼，RNA-seq工具面面觀）

生命力依然頑強(qiáng)

盡管RNA-seq有許多優(yōu)勢，但許多研究者還是在繼續(xù)使用芯片，尤其是樣本量比較大的研究。芯片在臨床研究中也很吃香，因?yàn)樗�的�?shù)據(jù)處理又快又簡單。“芯片能提供高度一致的數(shù)據(jù)，分析軟件也相當(dāng)成熟，”Poon說。“通過分析成百上千的樣本，基因和miRNA的表達(dá)特征已經(jīng)被賦予了臨床上的診斷價值�！�

“我會一直使用芯片，”MitoGenetics公司的Kirk Mantione說。“我知道要做些什么，結(jié)果也更容易解讀�！�

Mantione使用芯片對自己開發(fā)的藥物進(jìn)行評估，在細(xì)胞系和動物中分析這些藥物對基因表達(dá)的影響。芯片可以快速給出結(jié)果，展示藥物對特定基因的作用。不過Mantione也希望用RNA-seq研究那些還不成熟的生物模型，或者尋找之前沒有發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄本多態(tài)性。

有時候，人們繼續(xù)使用芯片只是因?yàn)橄胍獙π聰?shù)據(jù)和舊數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，如果所有的數(shù)據(jù)都是以同樣的方式獲得的，比較起來自然更為容易。

Affymetrix公司建議大家先用芯片快速篩查大量樣本，然后用這些結(jié)果指導(dǎo)RNA-seq。此外，芯片也可以用來驗(yàn)證RNA-seq的數(shù)據(jù)。

RNA-seq數(shù)據(jù)分析

RNA-seq有非常廣泛的應(yīng)用，但沒有哪個分析軟件是萬能的�？茖W(xué)家們一般會根據(jù)自己的研究對象和研究目標(biāo)，采用不同的數(shù)據(jù)分析策略�，F(xiàn)在人們已經(jīng)發(fā)表了大量的RNA-seq和數(shù)據(jù)分析方案，對于剛?cè)腴T的新手來說難免有些無所適從。

佛羅里達(dá)大學(xué)、加州大學(xué)Irvine分校等單位的研究人員在一月二十六日的Genome Biology雜志上發(fā)表文章，概述了RNA-seq生物信息學(xué)分析的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)和現(xiàn)有資源，為人們提供了一份帶有注釋的RNA-seq數(shù)據(jù)分析指南。這將成為開展RNA-seq研究的寶貴參考資料。

這份指南覆蓋了RNA-seq數(shù)據(jù)分析的所有主要步驟，比如質(zhì)量控制、讀段比對、基因和轉(zhuǎn)錄本定量、差異性基因表達(dá)、功能分析、基因融合檢測、eQTL圖譜分析等等。研究人員繪制的RNA-seq分析通用路線圖（標(biāo)準(zhǔn)Illumina測序），將主要分析步驟分為前期分析、核心分析和高級分析三類。前期預(yù)處理包括實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、測序設(shè)計(jì)和質(zhì)量控制。核心分析包括轉(zhuǎn)錄組圖譜分析、差異基因表達(dá)和功能分析。高級分析包括可視化、其他RNA-seq技術(shù)和數(shù)據(jù)整合。

研究人員在文章中探討了每個步驟所面臨的挑戰(zhàn)，也評估了一些數(shù)據(jù)處理方法的潛力和局限。此外，他們還介紹了RNA-seq數(shù)據(jù)與其他數(shù)據(jù)類型的整合。這種數(shù)據(jù)整合可以將基因表達(dá)調(diào)控與分子生理學(xué)和功能基因組學(xué)關(guān)聯(lián)起來，如今越來越受到研究者的歡迎。

（生物通）