在CRISPR/Cas9基因編輯中，人們可通過各種不同的方法來導(dǎo)入編輯工具。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染是一種普遍使用的方法，但未必適用于那些難于對(duì)付的細(xì)胞，比如人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）。若您的實(shí)驗(yàn)室中有電穿孔儀，那么不妨試試電穿孔的方法，將Cas9核酸酶導(dǎo)入細(xì)胞。

與借助質(zhì)粒導(dǎo)入Cas9基因序列方法相比較，電穿孔導(dǎo)入方法避免了殘留Cas9基因的持續(xù)表達(dá)，有效抑制了脫靶效應(yīng)。它無需經(jīng)過蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄•翻譯•表達(dá)的過程，可以實(shí)現(xiàn)快速有效的突變導(dǎo)入。Takara旗下公司Clontech的Guide-it Recombinant Cas9（Electroporation-Ready）就是專為此用途而設(shè)計(jì)的。

Guide-it Recombinant Cas9（Electroporation-Ready）是來源于野生型化膿性鏈球菌Streptococcus pyogenes，適用于CRISPR/Cas9基因編輯實(shí)驗(yàn)的重組Cas9蛋白質(zhì)溶液。高濃度Cas9蛋白質(zhì)溶液中的甘油濃度比其他公司低，特別適用于電穿孔導(dǎo)入方法。

不過，需要注意的是，Cas9導(dǎo)入細(xì)胞前首先需要形成Cas9-sgRNA核糖核蛋白復(fù)合物，sgRNA制備推薦使用Guide-it sgRNA In VitroTranscription Kit或者Guide-it Complete sgRNA Screening System。效果如何？請看下圖。

圖1. AAVS1或者CXCR4基因同源重組修復(fù)（HDR）效率

Guide-it Recombinant Cas9（Electroporation-Ready）和修復(fù)模板復(fù)合物通過電穿孔的方式導(dǎo)入至CD34＋造血干細(xì)胞中檢測同源重組修復(fù)（HDR）效率。將包含Hind III酶切位點(diǎn)的修復(fù)模板插入至AAVS1 基因中，包含Hind III和BamH I酶切位點(diǎn)的修復(fù)模板插入至CXCR4基因中。之后通過對(duì)細(xì)胞內(nèi)靶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增和限制酶剪切分析，確認(rèn)突變導(dǎo)入效率�；�因編輯效率標(biāo)注在凝膠陽性孔處。在基因編輯前野生型CXCR4基因已包含1處BamH I位點(diǎn)，因此BamH I剪切CXCR4基因后額外多顯示一條條帶。

圖2. 不同公司Cas9產(chǎn)品在hiPS細(xì)胞中基因敲除效率比較

剪切后電泳條帶的強(qiáng)弱可以半定量估計(jì)發(fā)生基因編輯細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。Guide-it Recombinant Cas9（Electroporation-Ready）與Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit制備的sgRNA相結(jié)合，通過電穿孔的方法導(dǎo)入Cellartis hiPSC-18細(xì)胞，采用Guide-it Mutation Detection Kit確認(rèn)突變導(dǎo)入效率，％即表示基因編輯效率。如圖所示，Guide-it Recombinant Cas9（Electroporation-Ready）在多數(shù)靶基因位點(diǎn)均顯示有效的基因編輯。

比較結(jié)果來自于Takara Bio USA, Inc.