今天的文章將圍繞m6A甲基化檢測方法展開，詳細(xì)闡述m6A甲基化檢測方法的具體步驟及優(yōu)劣勢，一起來學(xué)習(xí)吧~

最早發(fā)現(xiàn)的RNA甲基化修飾包括假尿苷和5mC等。在mRNA中，常見的修飾包括m6A、m1A、5mC等。早在上世紀(jì)70年代，人們已經(jīng)在真核生物的mRNA和lncRNA中發(fā)現(xiàn)了m6A修飾。但是受到技術(shù)手段的限制，檢測m6A尤其是對m6A進(jìn)行定量，甚至是從單堿基水平鑒定m6A，一直進(jìn)展緩慢。隨著高通量測序技術(shù)（next generation sequencing, NGS）的發(fā)展以及液相色譜靈敏度的提高，科學(xué)家們在此基礎(chǔ)上發(fā)展了多種m6A檢測方法。

目前檢測m6A所用的技術(shù)手段包括高通量測序、比色法以及液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS），具體方法包括MeRIP-seq、miCLIP-seq、SCARLET、LC-MS/MS等。下面就來介紹目前較為主流的四種檢測m6A的方法，其中LC-MS/MS和比色法能夠檢測mRNA整體的m6A水平，而m6A-seq和miCLIP-seq屬于高通量測序手段。

1．LC-MS/MS

圖1 LC-MS/MS檢測RNA中m6A水平分析流程圖

LC-MS/MS在液相質(zhì)譜的基礎(chǔ)上采用串聯(lián)質(zhì)譜，能夠獲得分子離子峰和碎片離子峰，可對堿基同時(shí)進(jìn)行定性和定量分析。

如圖1所示，第一步使用TRIzol提取完Total RNA后，既可以用oligodT磁珠對mRNA進(jìn)行富集，也可以使用rRNA去除試劑盒獲得包括mRNA、lncRNA等在內(nèi)的RNA。第二步使用核酸酶P1（Nuclease P1）將RNA從單鏈消化成單個(gè)堿基。第三步加入堿性磷酸酶和碳酸氫銨后孵育數(shù)小時(shí)，將樣本注射入液相色譜儀，根據(jù)出峰的保留時(shí)間面積計(jì)算各個(gè)堿基的含量。第四步進(jìn)入質(zhì)譜串聯(lián)分析，單個(gè)核糖核苷酸會被離子化，同時(shí)被打斷成五碳糖和嘧啶或嘌呤，最后根據(jù)出峰的保留時(shí)間計(jì)算m6A的面積。最后根據(jù)m6A和總腺嘌呤的比例就能算出m6A在mRNA上整體的甲基化程度。

2．比色法

 圖2 m6A甲基化定量試劑盒流程展示及結(jié)果

比色法與LC-MS/MS比較相似，也是從整體水平上檢測RNA上m6A甲基化水平。相對于LC-MS/MS較為繁瑣的操作，比色法更為簡便。研究人員既可以提取total RNA，也可以利用oligodT磁珠富集mRNA。Epigentek公司推出的這款名為EpiQuik M6A RNA Methylation Quantification Kit試劑盒其核心原理與ELISA反應(yīng)類似，經(jīng)過優(yōu)化后檢測m6A靈敏度會更高。

3．m6A-seq

 圖3 MeRIP-seq（m6A-seq）與miCLIP-seq實(shí)驗(yàn)流程

2012年之前，幾乎沒有從全基因組或全轉(zhuǎn)錄組水平上鑒定m6A修飾的文章。之后兩篇獨(dú)立發(fā)表的論文第一次從轉(zhuǎn)錄水平上，大范圍、高通量地鑒定了人和小鼠m6A的甲基化水平。這種方法被稱為MeRIP-seq或m6A-seq。

如圖3所示，第一步先對mRNA進(jìn)行片段化，接下來使用帶有m6A抗體的免疫磁珠對發(fā)生m6A甲基化的mRNA片段進(jìn)行富集，然后將富集到的mRNA片段純化后構(gòu)建高通量測序文庫進(jìn)行上機(jī)測序。另外需要單獨(dú)構(gòu)建一個(gè)普通的轉(zhuǎn)錄組文庫作為對照。最后將2個(gè)測序文庫放在一起進(jìn)行生物信息學(xué)分析，得到m6A甲基化程度較高的區(qū)域，也叫做m6A peak。

這種方法優(yōu)點(diǎn)是方便快捷成本低廉，可以對發(fā)生高甲基化的mRNA區(qū)域進(jìn)行一個(gè)定性分析。但是MeRIP-seq只能鑒定m6A高甲基化的區(qū)域，并不能做到單堿基的分辨率。送樣要求建議為肝臟、腦等轉(zhuǎn)錄較為活躍的組織，如果細(xì)胞樣本建議1x10⁹的細(xì)胞量（約為8板細(xì)胞以上）。最后總RNA含量推薦在800ug以上，mRNA富集在10-30ug以上才會進(jìn)入下游實(shí)驗(yàn)。

4．miCLIP-seq

已知miCLIP-seq等方法能夠?qū)�m6A做到單堿基的分辨率。這種方法也會用到m6A抗體，但是會使用紫外交聯(lián)的方法進(jìn)行免疫共沉淀。

如上圖3所示，第一步依舊是對富集完的mRNA進(jìn)行片段化。第二步，使用帶有m6A抗體免疫磁珠與帶有m6A的mRNA片段進(jìn)行結(jié)合。第三步，使用紫外交聯(lián)進(jìn)行免疫共沉淀后，在mRNA片段的3’端連上接頭序列，在5’端加上P32放射性標(biāo)記后進(jìn)行移膜。第四步，根據(jù)放射性標(biāo)記進(jìn)行切膜回收后，對mRNA片段進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和純化回收。第五步，對反轉(zhuǎn)錄組的cDNA進(jìn)行環(huán)化。第六步，對環(huán)化的cDNA進(jìn)行復(fù)線性化，然后構(gòu)建測序文庫上機(jī)測序。在這里采用P32放射性標(biāo)記屬于非必須選項(xiàng)。

今天的內(nèi)容講完啦，大家記得收藏好慢慢學(xué)習(xí)哦~

下期預(yù)告：m6A甲基化整體研究思路之m6A甲基化課題設(shè)計(jì)