今天的文章將圍繞RNA甲基化m6A后期驗證工具展開，詳細介紹了幾類高頻的驗證實驗，一起來學習吧~

前言

做完測序后需要對分析結果中感興趣的內容進行生物學功能驗證，一個完整的功能驗證將歷經分子細胞→細胞功能→動物實驗等形成完整的實驗思路。其中分子細胞包括RNA-RNA互作驗證（如miRNA與UTR互作驗證）等。細胞功能包括敲低/敲除/過表達、蛋白細胞定位、蛋白與蛋白互作、蛋白與RNA/DNA互作、細胞表型實驗（遷移侵襲、劃痕、增殖、凋亡、周期）等。最后的動物實驗主要指動物模型實驗，如小鼠、斑馬魚等。除了qPCR外，接下來的內容中會選擇其中幾個高頻的驗證實驗做介紹。

細胞蛋白定位/免疫熒光實驗

免疫熒光細胞化學是根據抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素制成的熒光標記物，再用這種熒光抗體或抗原作為分子探針檢查細胞或組織內的相應抗原或抗體。在細胞或組織中形成的抗原抗體復合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受到激光的激發照射而發出明亮的熒光（紅色或綠色），就可以看熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原就抗體的性質、定位，以及利用定量技術測定含量。

詳細protocol請查看： https://link.springer.com/protocol/10.1007/978-1-4939-3064-7_14 。驗證這類實驗可以大致觀察到一些重要的蛋白到底位于細胞核還是細胞質中等結果。

蛋白與蛋白互作（免疫共沉淀和GST pull down）

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation），簡稱Co-IP, 其原理是當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內存在的許多蛋白質－蛋白質間的相互作用被保留了下來, 如果用蛋白質X的抗體anti-X（通常稱為IP抗體）將X特異地抓住并沉淀下來，那么與X在體內結合的蛋白質Y或者Z等也能共同被沉淀下來。目前多用protein A/G預先固化在瓊脂糖或者磁珠beads上，protein A/G可以結合各種抗體，具有通用性，當然它們結合不同種屬來源的抗體的親和力有差異，比如Protein A結合兔抗的結合力比G稍強, 具體需參考產品的說明書。因此利用Co-IP實驗可以（1）測定兩種甚至更多種蛋白質是否在體內結合；（2）鑒定一種特定蛋白質的作用搭檔；（3）分離得到天然狀態的相互作用蛋白復合物。具體Co-IP相關的protocol詳見： https://link.springer.com/protocol/10.1007%2F978-1-62703-161-5_36 。

GST Pull-down

酵母雙雜交系統是將待研究的兩種蛋白質分別克隆（融合）到酵母表達質粒的轉錄激活因子的DNA結合結構域和轉錄激活域上，構建成融合表達載體，從表達產物分析兩種蛋白質相互作用的系統。

在此基礎上，GST pull-down實驗則是一個行之有效的驗證酵母雙雜交系統的體外試驗技術，近年來越來越受到廣大學者的青睞。其基本原理是將靶蛋白-GST融合蛋白親和固化在谷胱甘肽親和樹脂上，作為與目的蛋白親和的支撐物，充當一種“誘餌蛋白”，目的蛋白溶液過柱，可從中捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白”(目的蛋白)，洗脫結合物后通過SDS-PAGE電泳分析，從而證實兩種蛋白間的相互作用或篩選相應的目的蛋白，“誘餌蛋白”和“捕獲蛋白”均可通過細胞裂解物、純化的蛋白、表達系統以及體外轉錄翻譯系統等方法獲得。此方法簡單易行，操作方便。關于GST pull down以及其他蛋白-蛋白互作信息請查閱：https://link.springer.com/protocol/10.1007/978-1-60327-375-6_30 。

蛋白-RNA互作

RIP技術（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA結合蛋白免疫沉淀），是研究細胞內RNA與蛋白結合情況的技術，是了解轉錄后調控網絡動態過程的有力工具，能幫助我們發現miRNA的調節靶點、RNA結合蛋白調控的靶基因等。RIP這種新興的技術運用針對目標蛋白的抗體把相應的RNA-蛋白復合物沉淀下來，然后經過分離純化就可以對結合在復合物上的RNA進行分析。RIP可以看成是普遍使用的染色質免疫沉淀ChIP技術的類似應用，但由于研究對象是RNA-蛋白復合物而不是DNA-蛋白復合物，RIP實驗的優化條件與ChIP實驗不太相同（如復合物不需要固定，RIP反應體系中的試劑和抗體絕對不能含有RNA酶，抗體需經RIP實驗驗證等等）。RIP實驗結束后富集到的RNA，既可以直接用于qPCR，也可用于芯片和測序實驗等。RIP詳細protocol請查看：https://link.springer.com/protocol/10.1007/978-1-4939-6380-5_7。

表型分析（細胞功能學實驗）

細胞是生物有機體結構和功能的最小單位，體外細胞實驗是文章的重要組成部分，目前細胞功能實驗主要有：細胞增殖，對細胞分裂的速度進行評價；細胞凋亡，是相對復雜的過程，反映細胞自身的狀態，此過程與疾病的發生有密切的關系；細胞侵襲，反映的是腫瘤細胞的浸潤轉移的能力；細胞周期，反映細胞的增殖速度以及細胞處在的分裂期。此部分實驗一般是對細胞進行特定基因的過表達或者干擾沉默后，研究細胞的功能變化，進而評價該基因在細胞內的功能。

動物模型構建

人類疾病的動物模型(animal model of human disease)是指各種醫學科學研究中建立的具有人類疾病模擬表現的實驗動物。動物疾病模型廣泛應用于疾病機制研究、新藥靶點發現及篩選、藥效評價、轉化醫學等醫學前沿領域。目前實驗模型分為疾病模型和成瘤模型。疾病模型的造模方法包含藥物誘導、食物干預、手術等主流手段，造模后對主要的生理指標進行檢測，保證模型的質量和特異性。動物成瘤模型是目前最為廣泛應用的、也是腫瘤在體研究中最為普遍的手段。

動物模型造模后會有一系列的指標檢測保證模型特征性。腫瘤成瘤模型可以自行提供腫瘤細胞，也可以利用聯川生物細胞庫中的細胞進行成瘤。成瘤實驗一般需要進行預實驗驗證成瘤效果。

動物成瘤通常分為皮下成瘤和原位成瘤，一般步驟如下所示：

動物在體研究

動物在體研究包含病理研究和生理檢測，涵蓋動物病理解剖、組織石蠟切片制作、HE染色、特殊染色、免疫組織化學檢測等。成瘤模型或者疾病模型造模成功后，可以直接做生理檢測并按要求取材做病理分析。需要注意的是動物在體實驗建議在SPF級實驗室完成。

今天的內容講完啦，大家記得收藏好慢慢學習哦~

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