Takara IVTpro™ mRNA合成系統(tǒng)包含從DNA模板制備到mRNA合成實驗所需的全套工具。不僅可以用于mRNA相關(guān)的基礎(chǔ)研究，還可以用于mRNA疫苗、腫瘤免疫治療等應(yīng)用研究！

產(chǎn)品介紹

Takara IVTpro™ mRNA Synthesis System（Code No. 6141）是能夠簡便、高效合成帶有Cap結(jié)構(gòu)和Poly(A)序列的mRNA的體外轉(zhuǎn)錄試劑盒。它包含以下兩種制品（可單獨購買）：

① Cloning Kit for mRNA Template（Code No. 6143）：用于DNA模板構(gòu)建

本試劑盒用于將模板DNA無縫克隆到預(yù)線性化載體（包含在本試劑盒中）中構(gòu)建用于體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的模板質(zhì)粒。預(yù)線性化載體中包含T7 啟動子、轉(zhuǎn)錄起始序列 (AGG)、5'-UTR（非編碼區(qū)）、3'-UTR、和105-base Poly(A) 序列。試劑盒還包含用于將目標(biāo)DNA無縫克隆到預(yù)線性化載體的In-Fusion Snap Assembly Master Mix和FLuc對照片段（包括15 bp，3' In-Fusion sequence；FLuc CDS；和15 bp，5' In-Fusion sequence）。

② Takara IVTpro T7 mRNA Synthesis Kit（Code No. 6144）：RNA合成試劑

本試劑盒以含有 T7 啟動子序列的雙鏈 DNA 為模板，使用優(yōu)化的高效T7 RNA聚合酶，通過體外轉(zhuǎn)錄可合成大量mRNA。除此以外，還包含用于IVT反應(yīng)后消化模板DNA的DNase I和用于純化mRNA的氯化鋰 (LiCl) 溶液。真核細(xì)胞翻譯蛋白質(zhì)需要RNA的5'端有Cap結(jié)構(gòu)，配合使用CleanCap Reagent AG（TriLink公司的Cap類似物）可以高效制備具有Cap結(jié)構(gòu)的mRNA。

※ Cap類似物不包含在本產(chǎn)品中，請另外準(zhǔn)備CleanCap Reagent AG (TriLink公司)。 

產(chǎn)品特點

◇  通過體外轉(zhuǎn)錄（IVT）合成帶有Cap結(jié)構(gòu)和Poly(A)序列的mRNA；
◇  優(yōu)化的T7 RNA聚合酶用于IVT反應(yīng)，RNA合成效率高、產(chǎn)量大；
◇  獨立包裝的NTPs，方便修飾NTPs替換，且不影響mRNA產(chǎn)量；
◇  采用In-Fusion無縫克隆，輕松構(gòu)建模板質(zhì)粒DNA；
◇  使用氯化鋰（LiCl）溶液進行RNA純化，可立即進行下游應(yīng)用。

Takara IVTpro™ mRNA合成系統(tǒng)五大優(yōu)勢：

優(yōu)勢No.1：采用In-Fusion無縫克隆，輕松構(gòu)建模板質(zhì)粒DNA。

構(gòu)建參加IVT反應(yīng)的DNA模板質(zhì)粒操作非常簡單，只需設(shè)計好帶有In-Fusion序列的目標(biāo)基因（GOI），即可一步輕松完成模板質(zhì)粒的構(gòu)建！

優(yōu)勢No.2：通過體外轉(zhuǎn)錄（IVT）反應(yīng)合成帶有Cap結(jié)構(gòu)和Poly(A)序列的mRNA。

為什么要合成帶有Cap結(jié)構(gòu)的mRNA？

mRNA的5’端帽子結(jié)構(gòu)（m7GpppN）發(fā)現(xiàn)于上世紀(jì)70年代，它的存在賦予了mRNA穩(wěn)定性并使其能夠有效翻譯。在真核細(xì)胞中，除了識別蛋白質(zhì)合成的起始之外，5’端帽子結(jié)構(gòu)還充當(dāng)從5’到3’外切核酸酶切割的保護基團。也就是說5’Cap相當(dāng)于一頂鋼盔，保護mRNA不受免疫系統(tǒng)降解，因此Cap結(jié)構(gòu)對于mRNA疫苗研發(fā)很重要。本試劑盒配合使用CleanCap Reagent AG（TriLink公司的Cap類似物）可以高效制備具有Cap結(jié)構(gòu)的mRNA。

通過體外轉(zhuǎn)錄（IVT）反應(yīng)合成的 mRNA產(chǎn)量：

此圖分別為加入和不加入CleanCap Reagent AG (3'OMe)的情況下，IVT反應(yīng)溶液中合成Firefly luciferase (螢火蟲熒光素酶 ,FLuc) mRNA的產(chǎn)量。由此可見由此可見，Takara IVTpro™ mRNA合成系統(tǒng)兼容CleanCap試劑，使用CleanCap不影響mRNA產(chǎn)量。

優(yōu)勢No.3：優(yōu)化的T7 RNA聚合酶用于IVT反應(yīng)，RNA合成效率高、產(chǎn)量大。

使用本產(chǎn)品，每次反應(yīng)（20 μl 反應(yīng)體系）可以合成高達(dá) 200μg 或更多的RNA。還可以根據(jù)需要放大反應(yīng)體系，即使使用10倍（200μl）反應(yīng)體系也不影響mRNA預(yù)期產(chǎn)量!

IVT反應(yīng)規(guī)模與mRNA產(chǎn)量的關(guān)系：

此圖為以Positive Control Template（FLuc）為模板，加入 CleanCap Reagent AG (3'OMe)  進行IVT放大實驗（除反應(yīng)液量外均按說明書所述進行）。 由此可見，mRNA 產(chǎn)量與反應(yīng)體積成正比，并且按比例放大反應(yīng)溶液體積不會影響mRNA產(chǎn)量。

優(yōu)勢No.4：獨立包裝的NTPs，方便修飾NTPs替換，且不影響mRNA產(chǎn)量。

劑盒包含獨立包裝的NTPs，方便優(yōu)化或使用修飾NTPs（如假尿苷）進行替換，而且不會明顯降低mRNA的產(chǎn)量。

為什么要使用修飾的NTPs？

人體免疫系統(tǒng)會識別進入人體的各種物質(zhì)并將其清除，RNA也不能例外。而人體中本身就有的RNA，卻不會被人體免疫系統(tǒng)識別清除，如tRNA。經(jīng)科學(xué)家們研究發(fā)現(xiàn)這些tRNA上的尿苷和體外合成實驗獲得的RNA上的尿苷結(jié)構(gòu)稍有不同，稱之為假尿苷。而使用這種修飾的UTP，可以解決mRNA易被免疫系統(tǒng)識別而被清除的問題。

優(yōu)勢No.5：使用氯化鋰（LiCl）溶液進行RNA純化，可立即進行下游應(yīng)用。

本試劑盒除了提供用于IVT反應(yīng)后消化模板DNA的DNase I，還提供了用于純化mRNA的氯化鋰 (LiCl) 溶液，純化效果更加理想！

氯化鋰沉淀法純化RNA與離心柱法進行比較（Fluc mRNA）

在含有CleanCap Reagent AG（3'OMe）和N1-甲基假尿苷的IVT反應(yīng)溶液中合成FLuc mRNA，并分別通過LiCl沉淀法和離心柱法進行純化（NucleoSpin RNA Clean-up）。 結(jié)果顯示，用離心柱法僅一次洗脫(Elution x1)得到的RNA要比LiCl沉淀法要少，但兩次洗脫(Elution x2)的RNA量與LiCl沉淀法大致相同。所以使用離心柱法時我們建議進行兩次洗脫，而氯化鋰沉淀法僅需一次即可。

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