空間轉錄組學研究技術層出不窮，包括基于激光顯微切割技術的Geo-Seq、探針捕獲mRNA結合轉錄組測序、以及原位探針雜交加多輪超分辨熒光顯微成像技術(比如MERFISH)等。后者可以實現單細胞分辨率的空間轉錄組研究，更好地分析細胞類型組成、細胞之間的空間臨近、細胞通訊等。空間轉錄組學研究在加速，科學家們也在試圖找到一種評估標準來幫助他們確保使用的工具和技術能夠產生盡可能可靠、可用的數據�？茖W家們需要知道要注意哪些指標，以及可以期望的高質量數據是什么樣的。我們描述了四個關鍵問題，您可以在比較空間轉錄組學技術時用來評估數據質量。

靈敏度

與表達的轉錄本總數相比，一項技術能檢測到的轉錄本的相對數量，也稱為檢測效率。

每個細胞中每種表達RN的拷貝數都是有限的，通常情況下，即使是功能相關的基因也可以在相對較低的轉錄拷貝數下表達。在過去的十年中，科學家們一直在單細胞水平上研究轉錄組學，沒有空間背景，使用單細胞測序技術來了解細胞類型和狀態。與單細胞RNA測序相當或更好的靈敏度能提供對樣本細胞組成的詳細了解�？梢酝ㄟ^比較不同技術對共同基因的每個細胞檢測到的轉錄本數量來表征靈敏度。與單細胞測序相比，MERSCOPE具有更高的靈敏度。

靈敏度為何重要？

空間生物學能夠繪制組織中細胞的組成，這依賴于技術能夠檢測足夠數量的轉錄本的能力，以精細地描述細胞類型和狀態的變化。如果靈敏度有限，這項工作不可能實現。許多功能相關的基因在每個細胞中表達不到10個轉錄本拷貝，因此低靈敏度的空間工具可能無法檢測到這些基因，因此發現不了重要的生物學。更好的轉錄本檢測提高了跨應用領域的生物學相關性和檢測細胞間更細微變化的能力。

特異性

在生物樣本中與真實轉錄本相對應的報告轉錄本的比例。

對于具有單分子分辨率的空間轉錄組學技術，錯誤識別的轉錄本會產生噪音，從而掩蓋真實的生物學。

許多因素會影響空間轉錄組學的準確性，包括組織中游離的自體熒光、不完全的探針結合或分子擁擠。MERFISH使用抗錯條形碼方案來減少轉錄本檢測誤差，允許在生物組織熒光成像固有的噪聲出現時進行計算誤差校正。一些空間轉錄組學技術存在非特異性RNA探針結合的風險，但這也是可以克服的。MERFISH技術利用基質嵌入和組織透明化來減少異常RNA信號。

特異性可以通過將空間轉錄組學技術的數據與成熟的前身技術(如Bulk RNA測序或scRNA-seq)進行比較來表征。與scRNA-seq比較有助于將樣本中每種細胞類型的細胞數量變化與檢測到的基因表達譜進行比較分析。MERSCOPE能夠與單細胞RNA測序保持很強的相關性，即使是表達最低的轉錄本。

為何特異性很重要？

空間轉錄組數據必須準確地驗證已建立的生物學，為發現新的生物學提供堅實的基礎。不準確的數據可能導致不準確的結果和結論，因為轉錄本可能在基因沒有真正表達的細胞或組織部分中被檢測到。

當在單細胞水平上描述基因表達時，根據MERSCOPE數據，關鍵髓系細胞類型標志物CSF1R和CD14的表達在髓系細胞群中高度富集，如下圖所示的UMAP表示。然而，在其它空間轉錄組技術數據中，這些關鍵髓細胞標記物的富集是微弱的或不存在的。MERSCOPE高精度地再現了已知生物學，為擴展我們對生物學的理解提供了基礎。

信息密度

在給定的組織體積或區域內可以檢測到的信息量。

細胞的體積是有限的，每個細胞內所能檢測到的信息量直接影響著我們對生物學了解的多少。單分子空間轉錄組學方法是基于顯微鏡的，因此，每個組織體積所能檢測的信息量與光學系統的質量直接相關。MERSCOPE光學系統針對單分子檢測進行了優化。使用高數值孔徑物鏡，從每個單獨的轉錄本中檢測到更多的熒光，并且轉錄本在相機上看起來更小。在給定的組織體積內可以檢測到更多的轉錄本，每個細胞可以檢測到更多的信息。

為何信息密度很重要？

每個空間轉錄組學平臺都有一個限制，即每單位體積能準確檢測到多少轉錄本，且具有較高的準確性和特異性。檢測每個細胞的更多信息可以更精確地比較細胞之間的轉錄差異，并識別生物組織中細胞類型和狀態的更細微變化。超過信息密度的限制可能會影響準確性和靈敏度，導致數據在生物學上一致性差。

有效的多重能力

空間轉錄組學技術在一次實驗中可以檢測到的RNA數量。

需要注意的是，真正的多重檢測能力有時不受目標基因數量的限制，而是受噪聲底限，或環境背景信號的限制。在以噪聲為主的水平上表達的基因無法有效檢測。對于高度特異性和靈敏度的檢測，有效多重能力可以匹配目標多重能力，所有目標基因均能被有效的檢出。由于特異性和靈敏度較低，目標多重能力和有效多重能力之間可能存在較大差距，盡管想要檢測的基因數量更多，但實際只有少數基因被準確檢測到。因此，有效的多重能力可以理解為在噪聲底限之上精確檢測的基因數量與想要檢測的基因數量的比較。

為何有效的多重能力重要？

如果只有一小部分基因可以被可靠地檢測和識別，那么基因panel中基因數量再多也沒用。組織中不同類型的細胞表達不同RNA。為了獲得完整和精確的空間背景，研究人員需要在同一樣本中準確檢測數百種RNA。

空間轉錄組學的研究方法已經出現了爆炸式增長，但許多方法難以建立，不一致，并且需要大量的故障排除。商業平臺正在慢慢出現，截至2022年秋，Vizgen已經發布了大量的數據集。

MERSCOPE：如何符合高質量空間轉錄組數據標準？

綜上所述，高質量的空間轉錄組學數據需要具備高的靈敏度、特異性、信息密度以及有效的多重檢測能力。MERSCOPE提供高質量的空間轉錄組學數據，同時提供可擴展的功能范圍：

▪ 自定義gene panel設計—選擇與您的生物學問題最相關的基因
▪ 細胞邊界染色—精確的細胞分割和單細胞分析
▪ 多組學—檢測同一樣品中的RNA和蛋白質

有了高質量的數據，您可以在每個層面上揭示生物學的復雜性，從亞細胞表達到腫瘤、器官和重要組織中的細胞類型分化。滿懷信心地報告結果，以推進您的領域并產生持久的影響。

參考文獻：

1. Method of the year 2020: Spatially resolved transcriptomics. Nature Methods 18, (2021).
2. Zhang, M., Eichhorn, S.W., Zingg, B., et al. Spatially resolved cell atlas of the mouse primary motor cortex by merfish. Nature 598, 137–143 (2021).
3. Moffitt, J. R. & Zhuang, X. RNA imaging with multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization (MERFISH). Methods in Enzymology 572, 1–49 (2016).
4. Moffitt, J. R., Hao, J., Bambah-Mukku, D., et al. High-performance multiplexed fluorescence in situ hybridization in culture and tissue with matrix imprinting and clearing. PNAS 113, 14456–14461 (2016).