單顆粒基因組學從納升級海水中揭示豐富的非經典海洋病毒

《Nature Microbiology》：Single-particle genomics uncovers abundant non-canonical marine viruses from nanolitre volumes

【字體： 大 中 小 】 時間：2025年11月06日 來源：Nature Microbiology 19.4

　　

海洋中微觀生命的世界充滿了神秘，其中病毒作為最豐富的生物實體之一，在海洋生態系統中扮演著關鍵角色。然而，傳統的研究方法在揭示海洋病毒的完整多樣性方面面臨著巨大挑戰。宏基因組學雖然能夠提供病毒群落的整體視圖，但由于病毒的高度微多樣性和頻繁的基因橫向轉移，獲得的病毒宏基因組組裝基因組(vMAGs)往往片段化且不完整。而基于熒光激活病毒分選(FAVS)的單病毒基因組學雖然能夠獲得更完整的病毒基因組，但通量低且受限于光學檢測靈敏度，難以捕獲小型病毒顆粒。

在這項發表于《Nature Microbiology》的研究中，研究人員開發了一種名為環境微區室基因組學(EMCG)的革命性技術，為海洋病毒研究開辟了新途徑。該技術通過將樣品中的顆粒隨機分隔到皮升級的半透性膠囊(SPC)中，在每個膠囊內進行DNA擴增和條形碼標記，實現了從極小樣品體積（僅300納升海水）中高效獲取數千個單顆粒基因組序列。

關鍵技術方法包括：使用半透性膠囊(SPC)對海水樣本進行微區室化處理；在膠囊內進行堿性裂解和全基因組擴增(WGA-X)；組合條形碼標記技術實現單顆粒追蹤；Illumina測序和生物信息學分析。樣本來自2022年4月18日美國緬因灣布思貝港采集的海水。

顆粒捕獲的定量與鑒定

研究人員開發并試用了EMCG方法，該方法基于將水樣分隔在SPCs內。通過分析300納升緬因灣海岸海水樣本，獲得了2,037個單擴增基因組。基于SPC占據率和測序emSAGs的分類注釋，估計原核浮游生物細胞和DNA病毒樣顆粒的豐度分別為1.93×10⁹ L^-1和1.79×10¹⁰ L^-1，與流式細胞計數結果高度一致，表明emSAGs能夠以隨機取樣、整體性的方式定量代表分析樣本中的DNA顆粒。

對emSAGs進行初步分類顯示，病毒樣emSAGs占主導地位（1,791個），細胞樣emSAGs為193個，比例為9:1，與海洋表面病毒與細胞的平均比例相符。細胞樣emSAGs的分類組成與同一樣本中原核浮游生物cSAGs相似，且與同一海岸位置的既往研究一致。

病毒樣基因組組裝的質量

病毒樣基因組序列的質量在三種方法間存在差異。病毒樣emSAGs的平均長度（27 kbp）是vMAGs（2 kbp）的10倍以上，但低于vSAGs（56 kbp）。CheckV評估顯示emSAGs中高質量和中等質量基因組組裝的比例（54%）高于宏基因組重疊群（1%）和vSAGs（22%），表明EMCG在回收高質量基因組方面優于宏基因組學和FAVS。

通過網絡分析將emSAGs和vMAGs聚類為病毒操作分類單元(vOTUs)，結果顯示大多數emSAGs和vMAGs不與其他基因組組裝聚類，而多成員集群中最常見的配置是多個vMAGs與單個emSAG聚類，反映了emSAGs組裝完整性遠高于vMAGs。

非經典DNA顆粒的意外豐度

研究意外發現，含有emSAGs的大型病毒樣基因組集群(vOTUs)與病毒宏基因組讀數比例相關性較弱，且emSAGs數量最多的vOTU（26個）沒有招募到任何病毒宏基因組讀數，也沒有vMAG成員。這表明病毒emSAGs和vMAGs組成的差異不僅由宏基因組組裝片段化引起，還與獲取的DNA來源不同有關。

進一步分析顯示，這些缺乏宏基因組代表性的豐富vOTU屬于VC1099集群，包含Naomiviridae科的Noahvirus屬培養病毒。1.8%的病毒樣emSAGs（相當于樣本中豐度約3×10⁸ L^--1）聚類到VC1099，表明EMCG發現了一個與Noahvirus相關的豐富病毒譜系，而傳統病毒宏基因組學無法檢測到這些病毒。

Noahvirus獨特地使用非經典核苷酸dU替代dT，其基因組只能在phi29聚合酶幫助下產生經典DNA拷貝后才能測序。EMCG工作流程涉及使用phi29聚合酶擴增單個顆粒的gDNA，這解釋了Naomiviridae在emSAGs中的回收。而病毒宏基因組測序沒有進行預擴增，因為預擴增會在混合群落鳥槍法測序中引入嚴重偏差。

對VC1099 emSAGs所有contigs進行共組裝產生了兩個環化共組裝，長度約62 kbp，與已發表的Noahvirus分離株基因組長度相似。比對分析揭示了單個Naomiviridae顆粒間高頻率的核苷酸水平變異。通過搜索與兩個VC1099共組裝相似的contigs，在細胞SAGs中發現與Naomiviridae相關的小片段對齊，表明其可能感染海洋中最豐富的浮游細菌譜系，包括Rhodobacteraceae科的Amylibacter和Pelagibacteraceae科的Pelagibacter。

研究結論與意義

環境微區室基因組學(EMCG)作為一種新型方法，為環境樣品中單個細胞和細胞外遺傳元素的高通量、定量基因組測序提供了新平臺。該方法通過對樣品中的顆粒進行隨機區室化，無需復雜昂貴儀器即可實現數千個顆粒的測序，顯著提高了分析通量并降低了設備成本。

研究最重要的發現之一是揭示了海水中Naomiviridae的豐富度，并表明它們感染幾種最豐富的海洋浮游細菌譜系。這些病毒使用dU代替dT的非經典DNA修飾，可能幫助病毒逃避宿主免疫系統的檢測。研究結果表明，具有非經典DNA的病毒在特定海洋區域可能非常豐富，并在海洋微生物生態學中扮演關鍵角色，然而標準宏基因組學方法無法檢測到這些病毒。

EMCG技術為海洋和其他環境中病毒和其他細胞外遺傳元素的定量基因組內容分析提供了新機會。對海水中Naomiviridae普遍性的發現反映了提高我們對具有非經典DNA的細胞外遺傳元素的豐度、生態作用和生物技術潛力理解的重要性。EMCG從亞微升樣品體積中以單個顆粒分辨率解析病毒和微生物基因組內容的能力，也可能在環境微生物學之外的領域找到應用，如感染診斷和法醫學。