人血漿循環小細胞外囊泡的標志 核心脂質特征的多組學鑒定：ADAM10與磷脂酰絲氨酸PS(36:1)作為新型生物標志物

《Nature Cell Biology》：Multi-omics identify hallmark protein and lipid features of small extracellular vesicles circulating in human plasma

【字體： 大 中 小 】 時間：2025年11月29日 來源：Nature Cell Biology 19.1

　　

在人體錯綜復雜的循環系統中，除了紅細胞、白細胞等常規細胞成分，還存在著數十億計納米級別的“信使”——細胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）。這些由細胞釋放的膜性小泡（直徑約30-1000納米），如同微觀世界的瓶中信，攜帶蛋白質、脂質、核酸等活性物質，在細胞間穿梭，執行著免疫調節、器官間通訊、組織穩態維持等至關重要的生理功能，并與癌癥、心血管疾病等多種病理過程密切相關。然而，盡管其生物學和生物醫學意義重大，人類血漿中循環EVs的核心分子藍圖，尤其是構成其形態與功能基礎的蛋白質和脂質組成，至今仍籠罩在迷霧之中。

理解循環EVs的保守分子組成具有深遠意義。它不僅能夠揭示循環EVs的基本構成單元，提供高置信度的分子圖譜和相關生物通路，還有助于闡明EVs在人體內的生物發生、釋放和攝取機制。更重要的是，由于從細胞培養系統獲得的現有EV標志物在人類樣本中保守性有限，鑒定出適用于人血漿的穩健EV標志物，將能推動大規模人群研究，改進EV純化與表征技術，并為開發更安全的EV療法提供信息。

近期發表于《Nature Cell Biology》的一項研究，旨在系統性解析人類血漿中循環EVs的核心蛋白質和脂質組成。研究團隊對超過140份人血漿樣本進行了高分辨率分離，以富集循環EVs，并利用質譜技術系統構建了其定量蛋白質組（4500種蛋白質）和脂質組（829種脂質）圖譜。他們成功鑒定出一組高度保守的182種蛋白質和52種脂質，作為循環EVs的標志性分子特征。尤為重要的是，他們發現跨膜蛋白ADAM10和磷脂酰絲氨酸PS(36:1)能作為可靠的生物標志物，精確區分EVs與血漿中的非EV顆粒。這些發現為循環EV生物學提供了深入見解，并通過一個開源Shiny網絡工具（evmap.shinyapps.io/evmap/）共享，將成為研究界理解循環EV生物學的寶貴資源庫。

為開展此項研究，研究人員運用了幾項關鍵技術。首先，他們采用高分辨率密度梯度分離技術從人血漿中富集小EVs亞型，并通過多種生物化學和生物物理方法驗證EV的特性和分離純度。其次，他們利用基于質譜的蛋白質組學和靶向脂質組學平臺，分別對分離得到的血漿EVs和非EV顆粒進行了大規模、定量的分子譜分析。第三，他們開發并應用了機器學習算法，對獲取的多組學數據進行深度挖掘，以識別能夠區分EVs和非EV顆粒的關鍵分子特征。此外，研究還使用了表面生物素標記結合蛋白質組學來分析EVs的表面可及蛋白質，并通過TIM4親和捕獲等方法驗證了特定標志物。研究所用血漿樣本來源包括澳大利亞紅十字生命血液、EDCAD研究和AusDiab試驗隊列。

從人血漿中分離循環EVs

研究團隊采用自上而下的密度梯度分離方法，成功地從人血漿中富集了循環小EVs。Western blot分析顯示，豐富的血漿成分如白蛋白、載脂蛋白和AGO2主要分布在DGS的1-5組分，而小EVs標志物CD63則集中在密度約為1.09 g ml^-1的6-8組分。冷凍電鏡圖像證實，富集到的pEVs是形態完整、膜包被的球形囊泡，平均直徑約為220.4納米，且帶有凈負電荷。與單獨使用超速離心相比，該方法能更有效地分離EVs與非EV顆粒，從1毫升血漿中可獲得約8.7微克pEVs蛋白，相當于約42億個顆粒。

構建人類循環EVs的蛋白質組草圖

通過對38個人血漿樣本的pEVs進行蛋白質組學分析，研究定量了4631種蛋白質，其動態范圍寬廣，覆蓋了大量低豐度循環蛋白。主成分分析顯示，pEVs蛋白質組與非EV顆粒的蛋白質組存在明顯差異。差異豐度蛋白在pEVs中富集了與小型EVs相關的術語/通路，而非EVs則富含補體和凝血通路成分。研究進一步鑒定出259種在全部38個pEV樣本中均被定量到的“類別1”蛋白，其中182種在pEVs中顯著富集的蛋白被定義為pEV蛋白特征。這些特征蛋白與囊泡運輸、肌動蛋白細胞骨架調控等EV相關通路密切相關。

定義循環EVs的核心蛋白特征

研究發現，這182種pEV蛋白特征中，有151種是表面可及的，包括CD蛋白、整合素和膜聯蛋白等。通過分析已發表的蛋白質組數據，證實這些pEV蛋白特征在多個血漿或血清EVs研究以及不同的EV亞群中高度保守。在一個獨立的外部隊列中的驗證表明，177種pEV蛋白特征被檢測到，其中87.4%在其相應的組分中顯著富集，發現集和驗證集之間蛋白特征的 fold change 顯示出強正相關，強調了其跨人群的可重復性。

人類循環EVs的脂質組草圖

研究使用靶向脂質組學平臺分析了pEVs和非EV顆粒的脂質組。主成分分析顯示兩者的脂質組存在顯著差異。pEVs和體外培養細胞來源的EVs中高度富集的脂質包括膽固醇、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂等。超過30%的脂質在pEVs和非EVs之間存在差異豐度。富集于pEVs的脂質與EV生物發生相關，而非EVs中富集的脂質則主要是脂蛋白顆粒的成分。

循環EVs的核心脂質組

通過K均值聚類分析，研究確定了52種脂質作為pEV脂質特征，它們在與EV特征相關的脂質本體論術語中富集，如磷脂酰絲氨酸。相反，代表非EV脂質特征的114種脂質與脂質儲存和脂滴相關。對血漿DGS各組分的脂質組學分析進一步驗證了pEV脂質特征在EV富集組分中的特異性分布。

循環EVs的生物學蛋白和脂質標志物

研究利用機器學習算法驗證了EV和非EV蛋白特征面板區分兩者的能力，模型達到了97%的準確率。通過遞歸特征消除法，研究進一步確定了ADAM10蛋白以及PS(36:1)和CE(18:0)脂質組合作為區分EVs與非EV顆粒的最小特征集，具有強大的分類能力。實驗驗證表明，ADAM10在pEVs中普遍存在，并且與PS信號共同定位于一亞群pEVs上。

用于EV蛋白質組和脂質組數據的R/Shiny網絡工具

為了促進數據的廣泛利用，研究團隊開發了一個開源的R/Shiny網絡工具，允許用戶快速查詢其蛋白質組和脂質組數據集中的分子信息，評估特征保守性，并進行網絡分析和通路富集分析。

本研究通過整合多組學分析，系統性地解析了人類血漿中循環EVs的核心蛋白質和脂質組成，鑒定出一組高度保守的分子特征。研究所定義的“標志性分子特征”，特別是ADAM10和PS(36:1)，為循環EVs的精確識別和質量評估提供了可靠的生物標志物。這些發現不僅深化了對循環EV生物學的理解，而且通過提供的豐富分子圖譜和開源工具，為EV研究領域提供了寶貴的資源，有望推動EV在疾病診斷和治療中的臨床應用。