AMPK磷酸化WIP1促進DNA修復及腫瘤細胞放射抵抗的新機制

《Cell Death & Disease》：AMPK phosphorylates WIP1 to promote DNA repair and radioresistance in cancer cells

【字體： 大 中 小 】 時間：2025年11月30日 來源：Cell Death & Disease 9.6

　　

在我們的細胞中，DNA每時每刻都面臨著來自內源（如活性氧ROS）和外源（如電離輻射）的威脅，維持其穩定性是生命健康的基礎。一旦DNA發生損傷，特別是最嚴重的DNA雙鏈斷裂（DSB），細胞會迅速啟動一套復雜的DNA損傷應答（DDR）機制進行修復。組蛋白H2AX在Ser139位點的磷酸化，形成γH2AX，是DSB發生的最早期標志事件之一，它像一面“旗幟”，招募大量修復蛋白到損傷位點，形成可見的核焦點（foci）。然而，當損傷修復完成后，這面“旗幟”必須被及時撤下（即去磷酸化），以恢復基因組穩態，為應對下一次損傷做好準備。究竟是誰負責撤下這面關鍵的“旗幟”？這個過程又是如何被精確調控的？這些問題的答案對于理解基因組穩定性維持以及腫瘤（其發生發展與基因組不穩定性密切相關）的治療抵抗至關重要。

另一方面，細胞代謝狀態與DNA損傷修復之間存在深刻聯系。AMP活化蛋白激酶（AMPK）是細胞的核心能量感受器，在能量匱乏時被激活，重編程代謝以應對壓力。近年來越來越多的證據表明，AMPK也參與調控DDR，但其具體分子機制仍不清晰。尤其值得深思的是，作為公認的抑癌因子，AMPK在已癌變的細胞中扮演的角色卻復雜得多，甚至可能促進腫瘤細胞的存活，這種“雙刃劍”效應背后的機制亟待闡明。

發表在《Cell Death and Disease》的這項研究，正是從“葡萄糖剝奪可快速降低γH2AX水平”這一有趣現象入手，層層深入，最終揭示了AMPK通過直接磷酸化磷酸酶WIP1，從而促進DNA損傷修復和腫瘤細胞放射抵抗的全新通路。

研究人員綜合運用了多種關鍵技術方法：利用基因敲除（KO）、敲低（KD）及過表達細胞模型進行功能驗證；通過免疫共沉淀（Co-IP）和GST pull-down分析蛋白質相互作用；采用體外激酶實驗和磷酸化特異性抗體鑒定AMPK對WIP1的直接磷酸化位點；通過蛋白質穩定性分析（環己酰亞胺CHX追蹤）和體外去磷酸化實驗評估磷酸化對WIP1功能的影響；通過彗星實驗（Comet assay）和免疫熒光（IF）焦點分析評估DNA損傷與修復；并利用裸鼠異種移植瘤（CDX）模型和臨床乳腺癌組織樣本的免疫組化（IHC）分析進行體內驗證。

Activation of AMPK promotes dephosphorylation of γH2AX

研究人員發現，在不同類型的細胞（懸浮白血病細胞MOLM13、THP1和貼壁細胞293T、MCF7）中，葡萄糖剝奪或使用AMPK特異性激動劑（A769662, MK-8722）激活AMPK，均能迅速降低γH2AX的水平。這種效應并非主要通過調節ROS實現，并且在AMPK α1/α2雙敲除（DKO）的小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）中消失，表明AMPK的激活確實能促進γH2AX的去磷酸化，且該過程是AMPK依賴性的。

WIP1 is the primary phosphatase responsible for maintaining the γH2AX level

那么，AMPK是通過激活哪個磷酸酶來行使這一功能呢？以往研究提示PP2A或PP4C可能負責γH2AX的去磷酸化。但本研究發現，在293T和HeLa細胞中敲低PP4C，或過表達PP2AC、PP4C，均未能顯著影響γH2AX水平。相反，過表達WIP1能強力降低基礎狀態和DNA損傷劑（CPT）誘導下的γH2AX水平，并使其焦點完全消失；而敲低WIP1則導致γH2AX水平及其焦點持續升高。這些結果明確提示，在正常和損傷條件下，WIP1而非PP2A或PP4C，是負責γH2AX去磷酸化的主要磷酸酶。

AMPKa directly binds to WIP1

接下來，研究證實了AMPK與WIP1之間存在直接相互作用。免疫共沉淀和體外GST pull-down實驗均表明，AMPK的催化亞基AMPKα2能與WIP1直接結合。結構域映射分析將相互作用區域定位于WIP1的101-372氨基酸區段。有趣的是，WIP1能促進活化的AMPK（磷酸化形式）在細胞核內積聚，提示二者相互作用可能具有功能上的協同效應。

AMPK phosphorylates WIP1 at Thr25

核心問題在于AMPK如何調控WIP1。通過質譜分析和點突變篩選，研究團隊發現AMPK能夠直接磷酸化WIP1的第25位蘇氨酸（Thr25）。該位點在多種脊椎動物中高度保守。他們成功制備了識別p-WIP1 (T25)的特異性抗體，并通過體外激酶實驗證實，活化的AMPK復合物能使野生型WIP1（WT）而非T25A突變體發生磷酸化。激活AMPK能顯著增強內源性和外源性WIP1在T25位點的磷酸化水平。更重要的是，體外去磷酸化實驗表明，與WT相比，T25A突變體去磷酸化γH2AX的酶活性顯著降低，而模擬持續磷酸化的T25D突變體則活性更強。這證明AMPK對WIP1 Thr25的磷酸化增強了其磷酸酶活性。

The phosphorylation of Thr25 by AMPK increases WIP1 stability and enhances its binding affinity with γH2AX

機制探討表明，AMPK介導的磷酸化從兩方面增強了WIP1的功能。其一，磷酸化增強了WIP1的蛋白穩定性。T25A突變體比WT蛋白降解更快，泛素化水平更高，而在AMPK敲除細胞中，WIP1的降解也加速。AMPK激活劑能穩定WIP1蛋白，而抑制劑則相反。其二，磷酸化增強了WIP1與底物γH2AX的結合能力。T25A突變體與γH2AX的結合量顯著低于WT，并且其在染色質上的結合也更不牢固，更容易被鹽溶液洗脫。這表明Thr25磷酸化通過增強WIP1的穩定性和對其底物γH2AX的親和力，共同促進了γH2AX的有效去磷酸化。

WIP1 Thr25 is critical for DSB repair and radioresistance of cancer cells

最后，研究在細胞和動物水平驗證了該通路的生物學功能。在WIP1敲除的MCF7和HeLa細胞中回補WIP1 WT或T25A突變體，發現盡管電離輻射（IR）初期兩者DNA損傷程度相似，但T25A細胞在6小時和12小時后仍存在顯著的彗星尾和持續的γH2AX焦點，表明DSB修復延遲。同樣，表達酶活失活突變體D314A或使用WIP1抑制劑也會導致修復缺陷。體內成瘤實驗顯示，與表達WT的腫瘤相比，表達T25A的腫瘤對局部X射線照射更為敏感，生長受到顯著抑制。對臨床乳腺癌組織樣本的分析進一步顯示，AMPK活性與WIP1 T25磷酸化水平呈顯著正相關。這些結果強有力地證明，AMPK磷酸化WIP1 Thr25對于有效的DSB修復和癌細胞的放射抵抗至關重要。

P<0.05,P<0.01,**P<0.001 by 1-factor ANOVA with a post hoc t-test. Insignificant comparison(n.s) was not presented.'>

綜上所述，這項研究清晰地描繪了一條從代謝應激信號到DNA損傷修復調控的新通路：AMPK → WIP1 (Thr25) → γH2AX → DSB修復/放射抵抗。該發現不僅深化了對代謝與基因組穩定性交叉對話的理解，更揭示了AMPK在腫瘤中的“雙刃劍”角色：在正常細胞中，AMPK-WIP1軸通過促進修復維護基因組穩定，發揮抑癌作用；而在癌細胞中，該通路卻被劫持用以抵抗放療等基因毒性壓力，促進腫瘤存活。這提示，針對AMPK-WIP1軸的干預策略需要高度精準的時空和細胞類型特異性。抑制該通路可能成為增敏腫瘤放療的潛在新策略，但必須謹慎權衡其對正常組織基因組穩定性的潛在影響。這項研究為開發新的腫瘤治療組合方案提供了重要的理論依據和潛在的分子靶點。