靶向甲基化cg24067911通過BCL6-ATXN1-CDH1軸抑制結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究
《Oncogene》：Targeted methylation of cg24067911 suppresses colorectal cancer metastasis through BCL6-ATXN1-CDH1 axis
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時(shí)間：2025年12月03日
來源：Oncogene 7.3
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本研究針對(duì)結(jié)直腸癌(CRC)轉(zhuǎn)移機(jī)制不明確的臨床難題，利用CRISPR-dCas9-DNMT3a系統(tǒng)對(duì)潛在生物標(biāo)志物cg24067911進(jìn)行精準(zhǔn)甲基化編輯。研究發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)位于ATXN1基因增強(qiáng)子區(qū)域，其低甲基化通過增強(qiáng)BCL6結(jié)合活性上調(diào)ATXN1表達(dá)，進(jìn)而激活轉(zhuǎn)錄因子ATXN1對(duì)CDH2(N-cadherin)的調(diào)控，最終促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和腫瘤轉(zhuǎn)移。該研究首次揭示cg24067911/ATXN1/CDH2軸在CRC轉(zhuǎn)移中的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，為CRC預(yù)后預(yù)測(cè)和靶向治療提供了新策略。
在全球范圍內(nèi)，結(jié)直腸癌始終是威脅人類健康的重大疾病，其發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(shì)。更令人擔(dān)憂的是，約20%的患者在初診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移，即便接受根治性治療的患者中仍有25%最終會(huì)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。盡管科學(xué)家們對(duì)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究已持續(xù)數(shù)十年，涉及遺傳異常、轉(zhuǎn)移起始細(xì)胞、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤微環(huán)境等多個(gè)領(lǐng)域，但這些基礎(chǔ)研究成果向臨床實(shí)踐的轉(zhuǎn)化仍十分有限。轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌預(yù)后差、治療選擇有限，因此深入理解其轉(zhuǎn)移機(jī)制對(duì)于開發(fā)有效治療策略至關(guān)重要。
表觀遺傳修飾作為基因調(diào)控的主要媒介，在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中扮演重要角色。DNA甲基化作為表觀遺傳調(diào)控的核心組成部分，已被證明是強(qiáng)有力的癌癥診斷和預(yù)后標(biāo)志物。研究表明，伴有轉(zhuǎn)移和不伴轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌具有不同的DNA甲基化演化特征，且大多數(shù)DNA甲基化狀態(tài)在轉(zhuǎn)移發(fā)生前就已確立，提示DNA甲基化在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中起推動(dòng)作用。然而，以往研究多使用廣譜甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑（如地西他濱、阿扎胞苷等）來探索DNA甲基化功能，針對(duì)單個(gè)DNA甲基化位點(diǎn)在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中作用的機(jī)制研究仍然缺乏。
CRISPR(成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列)技術(shù)的出現(xiàn)為這一領(lǐng)域帶來了革命性突破。通過將催化失活的Cas9(dCas9)與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（如DNMT3A）融合，研究人員現(xiàn)在能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)特定基因組位點(diǎn)DNA甲基化模式的精準(zhǔn)操控。這些創(chuàng)新工具使得探索DNA甲基化變化與癌癥生物學(xué)表型之間的因果關(guān)系成為可能，并為開發(fā)靶向DNA甲基化的新型治療策略鋪平道路。
中山大學(xué)腫瘤防治中心團(tuán)隊(duì)前期基于801例結(jié)直腸癌患者和1021例對(duì)照的大規(guī)模隊(duì)列，建立了具有高精度的循環(huán)游離DNA甲基化標(biāo)志物預(yù)測(cè)診斷和預(yù)后模型。其中，cg24067911同時(shí)具有診斷價(jià)值和轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)效應(yīng)，提示其在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的潛在作用。值得注意的是，CpG位點(diǎn)cg24067911是一個(gè)尚未被研究報(bào)道的新型DNA甲基化位點(diǎn)，其宿主基因ATXN1是一個(gè)參與轉(zhuǎn)錄抑制的蛋白編碼基因，也是Notch信號(hào)通路的組成部分。然而，大多數(shù)關(guān)于ATXN1的研究集中在神經(jīng)學(xué)領(lǐng)域，其在癌癥中的功能知之甚少。
發(fā)表在《Oncogene》的這項(xiàng)研究，利用CRISPR/dCas9-DNMT3a系統(tǒng)成功編輯了目標(biāo)位點(diǎn)cg24067911的甲基化狀態(tài)，并通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明了其在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的作用。研究人員進(jìn)一步探索了下游關(guān)鍵基因ATXN1在結(jié)直腸癌中的功能，發(fā)現(xiàn)ATXN1可作為轉(zhuǎn)錄因子通過促進(jìn)CDH2(N-鈣黏蛋白)表達(dá)來誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移。同時(shí)，研究也驗(yàn)證了cg24067911/ATXN1的臨床意義。這些發(fā)現(xiàn)揭示了結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的新機(jī)制。
研究團(tuán)隊(duì)采用CRISPR-dCas9-DNMT3a系統(tǒng)對(duì)cg24067911進(jìn)行靶向甲基化編輯，通過高通量測(cè)序技術(shù)（ATAC-seq、RNA-seq）和染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)分析表觀遺傳特征。利用體外遷移侵襲實(shí)驗(yàn)（Transwell、劃痕愈合）和體內(nèi)小鼠轉(zhuǎn)移模型（脾臟注射、門靜脈注射）驗(yàn)證功能表型。臨床驗(yàn)證基于中山大學(xué)腫瘤防治中心的患者樣本隊(duì)列（40對(duì)組織用于dd-PCR，84對(duì)組織用于qRT-PCR，488對(duì)組織用于IHC），通過生物信息學(xué)分析（TCGA、Oncomine數(shù)據(jù)庫）支持研究發(fā)現(xiàn)。
cg24067911在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的作用鑒定
前期研究發(fā)現(xiàn)cg24067911低甲基化是結(jié)直腸癌的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物
，結(jié)直腸癌組織中cg24067911甲基化水平顯著低于正常組織。進(jìn)一步研究顯示，cg24067911低甲基化在結(jié)直腸癌進(jìn)展過程中逐漸加劇，轉(zhuǎn)移灶的甲基化水平顯著低于匹配的原發(fā)腫瘤。此外，根治性切除后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的病例比非復(fù)發(fā)病例表現(xiàn)出更明顯的低甲基化。這些數(shù)據(jù)共同強(qiáng)調(diào)了cg24067911低甲基化與疾病侵襲性相關(guān)。
為評(píng)估cg24067911低甲基化對(duì)結(jié)直腸癌進(jìn)展的因果效應(yīng)，研究人員采用CRISPR-dCas9-DNMT3a介導(dǎo)的DNA甲基化編輯系統(tǒng)上調(diào)目標(biāo)CpG位點(diǎn)cg24067911的甲基化水平
P<0.05,P<0.01, and**P<0.001.'>
。研究發(fā)現(xiàn)，cg24067911位點(diǎn)特異性甲基化成功后，ATXN1 mRNA表達(dá)下調(diào)，且cg24067911位于ATXN1基因的增強(qiáng)子區(qū)域。染色質(zhì)開放性測(cè)序(ATAC-seq)結(jié)果顯示，dCas9-DNMT3a處理的DLD-1細(xì)胞系在cg24067911位點(diǎn)區(qū)域的染色質(zhì)可及性降低。這些發(fā)現(xiàn)表明cg24067911甲基化可影響增強(qiáng)子功能。
cg24067911增強(qiáng)子的鑒定及其對(duì)ATXN1表達(dá)的調(diào)控影響
CpG位點(diǎn)cg24067911位于ATXN1的5'UTR區(qū)域，其甲基化有可能影響宿主基因的表達(dá)水平。RNA-seq結(jié)果顯示，與對(duì)照組細(xì)胞相比，dCas9-DNMT3a細(xì)胞中ATXN1 mRNA表達(dá)下調(diào)。表觀遺傳特征分析發(fā)現(xiàn)，cg24067911區(qū)域富含H3K4me1和H3K27ac組蛋白修飾，表明cg24067911位于增強(qiáng)子區(qū)域，且結(jié)直腸癌細(xì)胞中H3K27ac的顯著富集暗示該增強(qiáng)子在結(jié)直腸癌中被激活。
研究人員進(jìn)一步探索了參與增強(qiáng)子功能過程的轉(zhuǎn)錄因子。通過JASPAR數(shù)據(jù)庫和GeneHancer數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)可能結(jié)合cg24067911區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子，并基于TCGA結(jié)直腸癌隊(duì)列的RNA-seq數(shù)據(jù)篩選出與ATXN1 mRNA水平顯著相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。研究發(fā)現(xiàn)，敲低BCL6表達(dá)可導(dǎo)致ATXN1 mRNA表達(dá)顯著降低。染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)證明BCL6能夠結(jié)合cg24067911所在的增強(qiáng)子區(qū)域。
ATXN1促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移
研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)ATXN1表達(dá)可顯著降低結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移能力，而ATXN1過表達(dá)則促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移。然而，ATXN1表達(dá)改變對(duì)細(xì)胞增殖能力沒有顯著影響。在DLD-1或HCT116 dCas9-sgRNA3細(xì)胞中過表達(dá)ATXN1后，細(xì)胞的遷移能力得到恢復(fù)。
體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了ATXN1在結(jié)直腸癌中的功能，與陰性對(duì)照組相比，用shRNA-ATXN1處理的小鼠肝臟轉(zhuǎn)移病灶顯著減少。此外，利用dCas9-sgRNA3細(xì)胞構(gòu)建肝轉(zhuǎn)移模型，發(fā)現(xiàn)上調(diào)cg24067911甲基化水平顯著減弱了結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移進(jìn)程。這些結(jié)果與cg24067911甲基化/去甲基化的功能一致，提示cg24067911可能通過下游ATXN1影響結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移。
ATXN1作為轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控CDH2表達(dá)調(diào)節(jié)EMT
為探討潛在機(jī)制，研究人員進(jìn)行了GO/KEGG分析，發(fā)現(xiàn)cg24067911高甲基化和ATXN1低表達(dá)共同富集于細(xì)胞粘附相關(guān)通路。GSEA分析顯示，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)通路在ATXN1功能中富集，這可能是cg24067911/ATXN1促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。
Western blot和RT-qPCR證實(shí)，ATXN1可改變EMT標(biāo)志物的表達(dá)，ATXN1敲低降低了CDH2(N-鈣黏蛋白)表達(dá)，增加了CDH1(E-鈣黏蛋白)表達(dá)。基于STRING數(shù)據(jù)庫的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析觀察到ATXN1與CDH2之間存在直接關(guān)聯(lián)，表明CDH2可能是cg24067911/ATXN1在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵效應(yīng)因子。
ATXN1-ChIP實(shí)驗(yàn)證明ATXN1可結(jié)合CDH2啟動(dòng)子區(qū)(TSS-880~-597)。雙熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ATXN1與CDH2啟動(dòng)子結(jié)合可顯著增加CDH2轉(zhuǎn)錄，且當(dāng)結(jié)合位點(diǎn)突變時(shí)，這種效應(yīng)減弱。這些發(fā)現(xiàn)闡明了潛在機(jī)制：cg24067911去甲基化增強(qiáng)ATXN1表達(dá)，ATXN1作為CDH2的轉(zhuǎn)錄因子增加N-鈣黏蛋白表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移。
通過RT-qPCR檢測(cè)回顧性收集的結(jié)直腸癌樣本和配對(duì)癌旁正常組織中的ATXN1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌樣本中ATXN1顯著高于配對(duì)正常樣本。基于結(jié)直腸癌患者的免疫組化染色結(jié)果，腫瘤組織中ATXN1表達(dá)高于正常組織。此外，高ATXN1表達(dá)在IV期患者、奧沙利鉑耐藥患者和復(fù)發(fā)疾病患者中更為突出。預(yù)后方面，ATXN1高表達(dá)患者的總生存期顯著短于低表達(dá)患者，III期結(jié)直腸癌患者中無病生存期相對(duì)縮短。基于TCGA結(jié)直腸癌COAD隊(duì)列的生存分析顯示，ATXN1高表達(dá)與無病生存期降低相關(guān)。
P<0.05,P<0.01, and**P<0.001.'>
本研究基于大規(guī)模臨床人群篩查，通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)從機(jī)制上驗(yàn)證了cg24067911甲基化的作用。研究結(jié)果表明，結(jié)直腸癌中cg24067911低甲基化增強(qiáng)了與BCL6的結(jié)合，導(dǎo)致ATXN1上調(diào)并隨后促進(jìn)EMT。盡管靶向甲基化方法取得了良好的修飾效率，但這一觀察結(jié)果與最近強(qiáng)調(diào)增強(qiáng)子區(qū)域位點(diǎn)特異性表觀遺傳編輯技術(shù)挑戰(zhàn)的報(bào)告一致。不完全甲基化可能源于染色質(zhì)可及性障礙，因?yàn)锽CL6結(jié)合的增強(qiáng)子的天然開放構(gòu)型可能抵抗DNMT3A介導(dǎo)的甲基化，加上組蛋白修飾串?dāng)_的潛在影響。
盡管ATXN1之前被報(bào)道能夠以Notch依賴性方式調(diào)節(jié)EMT，但N-鈣黏蛋白調(diào)控的表觀遺傳機(jī)制尚未完全闡明。本研究首次揭示cg24067911甲基化下調(diào)ATXN1表達(dá)，而ATXN1是CDH2的轉(zhuǎn)錄因子，從而導(dǎo)致N-鈣黏蛋白上調(diào)，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT并削弱細(xì)胞間粘附，促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移。
結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制中cg24067911的反復(fù)低甲基化可能源于多方面的機(jī)制，其中區(qū)域癌化可能在癌前上皮中啟動(dòng)早期去甲基化，為后續(xù)致癌突變創(chuàng)造許可染色質(zhì)，而同時(shí)發(fā)生的BCL6-ATXN1軸失調(diào)可能通過甲基化缺失穩(wěn)定BCL6結(jié)合，形成促進(jìn)ATXN1抑制的正反饋循環(huán)。臨床上，這些甲基化動(dòng)力學(xué)具有雙重前景：通過縱向監(jiān)測(cè)作為液體活檢早期檢測(cè)生物標(biāo)志物，以及作為治療脆弱性，其中EZH2抑制劑可能潛在地破壞BCL6依賴性。
該研究源自大規(guī)模隊(duì)列分析，并通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)從機(jī)制上驗(yàn)證了cg24067911甲基化的作用。研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌中cg24067911低甲基化增強(qiáng)了與BCL6的結(jié)合，導(dǎo)致ATXN1上調(diào)并隨后促進(jìn)EMT。需要進(jìn)一步研究來評(píng)估CRISPR/dCas9-DNMT3a在cg24067911上對(duì)結(jié)直腸癌的臨床應(yīng)用潛力。
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