缺氧誘導(dǎo)的USP13通過穩(wěn)定ACLY驅(qū)動(dòng)肝細(xì)胞癌鐵死亡抵抗和腫瘤免疫逃逸
《Cell Death Discovery》：Hypoxia-induced USP13 expression drives ferroptosis resistance and tumor immune evasion in hepatocellular carcinoma through the stabilization of ACLY
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時(shí)間：2025年12月04日
來源：Cell Death Discovery 7
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本研究針對(duì)肝細(xì)胞癌(HCC)預(yù)后差、治療抵抗等臨床難題，揭示了缺氧微環(huán)境通過HIF-1α/USP13/ACLY軸促進(jìn)膽固醇代謝重編程的新機(jī)制。研究人員發(fā)現(xiàn)USP13抑制劑2-甲氧基雌二醇(2-Met)可有效誘導(dǎo)鐵死亡、增強(qiáng)CD8+ T細(xì)胞毒性，證實(shí)靶向USP13通過去泛素化穩(wěn)定ACLY蛋白，為聯(lián)合免疫治療提供了新靶點(diǎn)。該成果發(fā)表于《Cell Death Discovery》，為改善HCC治療效果提供了理論依據(jù)。
肝細(xì)胞癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)是全球最常見的原發(fā)性肝臟惡性腫瘤，占所有肝癌病例的90%以上。這種癌癥以其侵襲性強(qiáng)、進(jìn)展迅速和高復(fù)發(fā)率為特征，導(dǎo)致患者臨床預(yù)后極差。盡管手術(shù)切除、化療、放療、靶向治療和免疫治療等手段不斷進(jìn)步，晚期肝細(xì)胞癌的治療選擇仍然有限，患者五年生存率低于15%。因此，開發(fā)更有效的治療策略成為當(dāng)前肝癌研究領(lǐng)域的迫切需求。
在細(xì)胞生命活動(dòng)中，泛素化(ubiquitination)作為一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，通過泛素激活酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2)和泛素連接酶(E3)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，精確調(diào)控著細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞凋亡、DNA修復(fù)和蛋白質(zhì)降解等關(guān)鍵過程。而與泛素化過程相反，去泛素化酶(deubiquitinating enzymes, DUBs)則能夠移除靶蛋白上的泛素分子，逆轉(zhuǎn)泛素化信號(hào)，為細(xì)胞功能調(diào)控提供了另一層精細(xì)的調(diào)控機(jī)制。在人類基因組中，大約編碼有100種去泛素化酶，根據(jù)其序列和催化結(jié)構(gòu)域可分為6個(gè)家族。
近年來，去泛素化酶在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用日益受到關(guān)注。其中，泛素特異性蛋白酶13(ubiquitin-specific protease 13, USP13)因其在調(diào)控癌癥相關(guān)細(xì)胞過程中的重要作用而成為研究熱點(diǎn)。2-甲氧基雌二醇(2-Methoxyestradiol, 2-Met)作為一種從天然化合物庫中篩選出的USP13抑制劑，已在非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌等腫瘤中顯示出良好的抗腫瘤效果，但其在肝細(xì)胞癌中的具體作用和機(jī)制尚不清楚。
鐵死亡(ferroptosis)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種鐵依賴性的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡形式，以鐵依賴性脂質(zhì)過氧化物的致死性積累為特征。研究表明，鐵死亡在腫瘤抑制中扮演著重要角色，為癌癥治療提供了新的思路。同時(shí)，膽固醇代謝與鐵死亡敏感性之間存在密切聯(lián)系，而腫瘤微環(huán)境中的膽固醇水平也直接影響著CD8+ T細(xì)胞的功能狀態(tài)。然而，這些過程在肝細(xì)胞癌中的具體調(diào)控機(jī)制仍有待闡明。
針對(duì)這些科學(xué)問題，中南大學(xué)湘雅醫(yī)院的研究團(tuán)隊(duì)在《Cell Death Discovery》上發(fā)表了最新研究成果，系統(tǒng)揭示了缺氧誘導(dǎo)的USP13表達(dá)通過穩(wěn)定ATP檸檬酸裂解酶(ATP citrate lyase, ACLY)驅(qū)動(dòng)肝細(xì)胞癌鐵死亡抵抗和腫瘤免疫逃逸的作用機(jī)制。
本研究綜合利用了多種前沿技術(shù)方法：采用患者來源類器官(Patient-derived organoids, PDOs)模型和肝癌細(xì)胞系進(jìn)行體外功能驗(yàn)證；通過免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜分析(Co-IP/MS)篩選USP13相互作用蛋白；利用單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)分析腫瘤免疫微環(huán)境特征；建立C57BL/6小鼠異種移植瘤模型和DEN誘導(dǎo)的原發(fā)性肝癌模型進(jìn)行體內(nèi)功能驗(yàn)證；通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)代謝組學(xué)分析膽固醇代謝變化；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脂質(zhì)活性氧(lipid ROS)、谷胱甘肽(GSH)水平和免疫細(xì)胞浸潤情況。
研究人員首先評(píng)估了USP13抑制劑2-Met在肝細(xì)胞癌中的抗腫瘤效果。通過6例患者來源類器官模型驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，2-Met處理顯著降低了類器官的細(xì)胞活力，Calcein AM/PI染色和結(jié)晶紫染色結(jié)果均顯示2-Met處理組細(xì)胞死亡增加。臨床樣本分析表明，USP13在肝癌組織中高表達(dá)，且與患者不良預(yù)后顯著相關(guān)。代謝組學(xué)分析顯示，2-Met處理引起了膽固醇代謝通路的顯著改變，提示膽固醇代謝可能參與USP13介導(dǎo)的腫瘤促進(jìn)作用。
USP13驅(qū)動(dòng)細(xì)胞增殖、干性和膽固醇代謝同時(shí)抑制鐵死亡
進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，2-Met處理顯著抑制了LM3和Hep3B肝癌細(xì)胞的增殖能力、克隆形成能力和腫瘤球形成能力。同時(shí)，2-Met顯著降低了細(xì)胞內(nèi)的膽固醇和膽固醇酯水平。在鐵死亡研究方面，2-Met增強(qiáng)了鐵死亡誘導(dǎo)劑RSL3的敏感性，這種效應(yīng)可被鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1逆轉(zhuǎn)。2-Met處理還導(dǎo)致脂質(zhì)ROS水平升高、GSH水平降低以及鐵離子濃度增加。通過直接敲低USP13基因驗(yàn)證了類似表型，證實(shí)了USP13在調(diào)控膽固醇代謝和鐵死亡中的關(guān)鍵作用。
USP13介導(dǎo)肝細(xì)胞癌中T細(xì)胞功能
通過分析公共單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)集，研究人員發(fā)現(xiàn)USP13高表達(dá)腫瘤中T細(xì)胞浸潤顯著減少，且浸潤T細(xì)胞中CD8、顆粒酶B(Granzyme B, GZMB)和干擾素γ(IFN-γ)表達(dá)降低。體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明，2-Met處理的肝癌細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷作用更加敏感，同時(shí)促進(jìn)了CD8+ T細(xì)胞分泌GZMB和IFN-γ。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，2-Met治療顯著抑制了腫瘤生長，增加了腫瘤內(nèi)CD8+ T細(xì)胞浸潤，并提高了T細(xì)胞中GZMB和IFN-γ的表達(dá)水平。機(jī)制上，USP13通過調(diào)控膽固醇代謝影響CD8+ T細(xì)胞功能，膽固醇補(bǔ)充可逆轉(zhuǎn)USP13缺失誘導(dǎo)的T細(xì)胞功能增強(qiáng)。
USP13直接結(jié)合并穩(wěn)定ACLY
為闡明分子機(jī)制，研究人員通過免疫共沉淀-質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)USP13與ACLY存在直接相互作用。免疫共沉淀和免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)了內(nèi)源性USP13與ACLY在細(xì)胞質(zhì)中的共定位。結(jié)構(gòu)域分析表明，USP13的USP和UBA結(jié)構(gòu)域與ACLY的CoA連接酶結(jié)構(gòu)域直接結(jié)合。功能實(shí)驗(yàn)顯示，USP13缺失降低了ACLY蛋白水平但不影響其mRNA表達(dá)，且這種效應(yīng)可被蛋白酶體抑制劑MG132逆轉(zhuǎn)。USP13通過其去泛素化活性特異性清除ACLY上K48連接的多聚泛素鏈，延長ACLY蛋白半衰期。定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定K726是USP13去泛素化ACLY的關(guān)鍵位點(diǎn)。
缺氧誘導(dǎo)的USP13表達(dá)通過ACLY促進(jìn)HCC進(jìn)展
機(jī)制上，研究人員發(fā)現(xiàn)缺氧微環(huán)境是驅(qū)動(dòng)USP13高表達(dá)的重要因素。TCGA數(shù)據(jù)分析顯示HIF-1α與USP13表達(dá)呈正相關(guān)。啟動(dòng)子分析和熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)HIF-1α通過結(jié)合USP13啟動(dòng)子的Region#2區(qū)域轉(zhuǎn)錄激活USP13表達(dá)。缺氧條件或HIF-1α過表達(dá)可誘導(dǎo)USP13和ACLY的上調(diào)，而USP13敲低則消除了缺氧誘導(dǎo)的ACLY上調(diào)和穩(wěn)定性增加。挽救實(shí)驗(yàn)表明，外源性過表達(dá)ACLY可逆轉(zhuǎn)USP13缺失誘導(dǎo)的抗腫瘤效應(yīng)。
本研究系統(tǒng)揭示了缺氧-HIF-1α-USP13-ACLY信號(hào)軸在肝細(xì)胞癌中的重要作用。在肝癌特有的缺氧微環(huán)境中，HIF-1α轉(zhuǎn)錄激活USP13表達(dá)，升高的USP13通過去泛素化穩(wěn)定ACLY蛋白，進(jìn)而促進(jìn)膽固醇代謝重編程。這一過程不僅增強(qiáng)了肝癌細(xì)胞對(duì)鐵死亡的抵抗能力，還通過改變腫瘤微環(huán)境中的膽固醇代謝抑制CD8+ T細(xì)胞的功能，最終導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸。
該研究的創(chuàng)新性在于首次將缺氧信號(hào)、去泛素化修飾、代謝重編程和免疫調(diào)控等多個(gè)重要生物學(xué)過程有機(jī)整合，闡明了USP13在肝細(xì)胞癌中同時(shí)調(diào)控鐵死亡敏感性和抗腫瘤免疫的雙重功能。研究結(jié)果表明，靶向USP13不僅能夠直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞鐵死亡，還能增強(qiáng)T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)，為肝細(xì)胞癌的治療提供了新的聯(lián)合治療策略。特別是USP13抑制劑2-甲氧基雌二醇在臨床前研究中展現(xiàn)出的良好抗腫瘤效果，為其進(jìn)一步的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。
這項(xiàng)研究不僅深化了對(duì)肝細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)制的理解，也為開發(fā)針對(duì)腫瘤代謝-免疫交叉對(duì)話的新型治療策略提供了重要線索，具有重要的理論意義和臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值。
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