空間轉錄組學標準化評估新框架：多中心多平臺驗證與質量度量工具SpatialQM的開發(fā)

《Nature Biotechnology》：Standardized metrics for assessment and reproducibility of imaging-based spatial transcriptomics datasets

【字體： 大 中 小 】 時間：2025年12月04日 來源：Nature Biotechnology 41.7

　　

在生物醫(yī)學研究領域，空間轉錄組學技術正以前所未有的分辨率揭示著組織的分子和細胞架構。然而，隨著該技術的快速發(fā)展，一個嚴峻的問題逐漸浮現：缺乏統(tǒng)一的標準化的質量評估指標。不同平臺、不同實驗室產生的數據質量參差不齊，使得跨研究比較變得困難重重，這嚴重阻礙了該領域的進一步發(fā)展。正如微陣列和測序技術發(fā)展初期經歷的標準化進程一樣，空間轉錄組學也迫切需要建立系統(tǒng)性的評估策略來解決可重復性問題。

目前的研究存在明顯局限：樣本數量有限、組織類型范圍狹窄、缺乏重復實驗以及匹配的單細胞參考數據。這種現狀與當年微陣列和測序技術的MAQC/SEQC項目面臨的情形驚人相似。技術平臺之間的差異、細胞分割算法的不一致、基因面板設計的多樣性，以及實驗操作的變異性，所有這些因素共同構成了空間組學數據比較和整合的主要障礙。

為了應對這些挑戰(zhàn)，國際研究團隊在《Nature Biotechnology》上發(fā)表了題為"Standardized metrics for assessment and reproducibility of imaging-based spatial transcriptomics datasets"的重要研究。這項工作通過多中心、多平臺的協(xié)作，建立了全面的評估框架，為空間轉錄組學數據的質量控制和標準化分析提供了重要工具。

研究人員開發(fā)了一套完整的研究體系，主要包括三個核心組成部分：標準化操作流程(STSOPs)、開源軟件包SpatialQM和網絡交互式數據庫Spatial Touchstone Portal(STP)。研究采用了六種組織類型（包括正常組織和癌組織），通過中心化切片處理，在多個全球站點使用Xenium和CosMx平臺進行分析。這些平臺因其廣泛應用和不同的化學原理而被選中。研究特別關注了技術性能的多個維度，包括準確性、精密度、可重復性、靈敏度和特異性。

技術方法方面，研究采用了系統(tǒng)化的實驗設計，包括樣本處理、平臺比較和數據分析三個主要環(huán)節(jié)。樣本來源包括正常組織（闌尾、結腸、胰腺、回腸）和癌組織（乳腺癌和前列腺癌），所有樣本均進行福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)處理。實驗設計包含多中心驗證，樣品在三個主要站點（阿德萊德大學、威爾康奈爾醫(yī)學院、圣猶達兒童研究醫(yī)院）進行處理，同時在10x Genomics總部進行額外實驗。核心技術包括成像空間轉錄組學（Xenium和CosMx平臺）、單核RNA測序(snRNA-seq)以及H&E染色分析。數據分析依托自主研發(fā)的SpatialQM軟件進行標準化質量度量計算。

技術指標評估

研究團隊建立了一套全面的技術性能指標。在轉錄本水平上，他們評估了每個細胞的轉錄本數(TPC)、單位面積的轉錄本數(TPA)和每個細胞核的轉錄本數(TPN)。ST數據集的TPC范圍為0.07-0.95（標準化值），平均為0.29±0.24，而PUB數據集顯示出更高的平均值0.82±0.55。特別值得注意的是，TPN指標能夠獨立于細胞分割效果，直接反映細胞核內的轉錄本檢測情況，ST數據集的TPN平均值為73±52.86。

探針特異性通過"特異性錯誤發(fā)現率(specificityFDR)"指標進行評估，ST數據集的特異性FDR值范圍為5.5×10^-5至0.069，顯著優(yōu)于PUB數據集的范圍（8.2×10^-5至0.69）。信噪比(SNR)和動態(tài)范圍評估顯示，ST數據集的SNR均值為0.28±0.08，動態(tài)范圍均值為4.11±1.03，表現出比PUB數據集更穩(wěn)定的性能。

細胞分割質量通過相互排斥相關比(MECR)進行量化，該指標評估本應互斥的基因在同一細胞中共表達的情況。ST數據集的MECR均值為0.05±0.02，明顯低于PUB數據集的0.13±0.18。此外，稀疏性(sparsity)、熵(entropy)和復雜性(complexity)等指標也提供了對數據質量的深入洞察。特別是歸一化復雜性(normComplexity)指標，它解釋了不同平臺間面板大小的差異，使跨平臺比較成為可能。

可重復性度量

通過主成分分析(PCA)發(fā)現，成像平臺的選擇是區(qū)分樣本的主要因素，而非樣本或數據集本身的不同。Xenium和CosMx樣本在主成分1(PC1)上明顯分離，PC1解釋了總方差的34.39%。研究還發(fā)現，盡管不同平臺的細胞分割算法導致細胞計數存在差異，但平臺檢測主要細胞類型的能力基本一致。

在乳腺癌樣本的對比分析中，ST數據集顯示出更高的一致性，其熵值范圍為0.40-0.68（均值0.55±0.1），而PUB數據集的熵值變異更大（0.58-1.03，均值0.75±0.2）。空間自相關分析使用莫蘭I(Moran's I)統(tǒng)計量，ST和PUB數據集的平均莫蘭I分數分別為0.080和0.144，進一步證實了ST數據集具有更好的可重復性。

生物學質量指標

通過單核RNA測序(snPATHO-seq)數據驗證顯示，Xenium平臺與參考數據在整個動態(tài)范圍內均表現出良好相關性（Spearman's ρ=0.78），而CosMx樣本的相關性較低（Spearman's ρ=0.60），且對低表達基因的檢測存在系統(tǒng)性偏高。細胞類型注釋的一致性分析表明，Xenium的平均細胞類型相關系數為0.78，而CosMx的變異性較高（均值0.57）。

細胞分割對轉錄本定量的準確性有重要影響。研究比較了三種分割策略：不同距離的細胞核擴展、基于染色的形態(tài)學分割和Proseg算法。結果顯示，Proseg分割在保持高純度的同時，獲得了比多模式分割多1.7倍的TPC（128.3對74.6），且產生的聚類更加清晰。

多組學分析評估

研究還探討了空間轉錄組學與空間蛋白質組學之間的相關性。使用Xenium進行轉錄組分析，CosMx進行蛋白質組分析，評估了總細胞核計數(TNC)、每個細胞的熒光強度(FPC)、復雜性、熵、稀疏性和SNR等技術指標。通過MaxFuse方法整合多組學數據，發(fā)現在共享嵌入空間中RNA和蛋白質模態(tài)存在顯著重疊，平滑肌細胞在RNA數據中過度呈現，而上皮細胞類型在兩種檢測中均表現出良好對齊。

研究的核心貢獻在于建立了空間轉錄組學的標準化評估框架。ST數據集相比PUB數據集顯示出更窄的技術變異性，證明了標準化操作流程在提高數據可重復性方面的價值。特別是STSOPs的實施顯著降低了特異性FDR和SNR測量的變異性。然而，研究也指出了一些局限性，如中心化的組織切片處理限制了對站點間前處理步驟變異的全面評估，未來研究需要納入分散化的前處理流程。

技術指標的解釋需要綜合考慮組織類型、探針面板和平臺特性。例如，FTC和TPC等指標嚴重依賴于細胞分割的準確性，而稀疏性和熵指標對面板特異性和分割質量敏感。MECR雖然在檢測上皮、免疫和基質區(qū)室中的錯誤分配方面表現良好，但在不同組織類型間的穩(wěn)健性仍需進一步驗證。

細胞分割算法的持續(xù)發(fā)展，特別是基于像素的分割無模型，有望通過直接從組織圖像學習特征，繞過傳統(tǒng)對細胞膜或細胞核標記的依賴，從而實現跨平臺和組織類型的通用比較。基因面板設計也是影響數據質量和可解釋性的關鍵因素，定制化面板針對特定組織類型能夠提高分析效率和清晰度。

該研究為空間組學領域建立了重要的基準框架，通過標準化度量和工具促進了數據的可比性和平臺評估。隨著空間技術應用擴展到更廣泛的組織類型、平臺和實驗環(huán)境，這些指南預期將不斷演進和完善，推動空間組學領域向更標準化、可重復的方向發(fā)展。

研究的獨特實驗設計使得能夠全面評估這些分析的可重復性。連續(xù)切片在同一機構內順序處理，突出了Xenium和CosMx平臺的一致性。相鄰組織切片在不同站點處理后產生的數據高度一致，相關系數通常超過0.95（平均r=0.97）。與單核RNA測序數據的比較驗證了所有測定中100%的細胞類型均被呈現，且比例非常相似，這強調了ST數據集在捕捉組織細胞景觀方面的準確性和實用性。

總的來說，這項全球性、多機構、多平臺的研究通過站點內和站點間的重復測量，評估了成像空間轉錄組學技術，建立了跨平臺的關鍵指標，突出了互補優(yōu)勢和挑戰(zhàn)。隨著STP隨著用戶生成數據集的不斷增長，空間轉錄組學的規(guī)模和穩(wěn)健性將不斷提高，有望在各種組織類型和條件下產生更一致的SNR、動態(tài)范圍和FTC值。這項工作為促進空間組學數據的比較性分析和標準化實踐奠定了重要基礎，將加速該領域的科學進展和治療發(fā)現。