USP16 S-硝基化通過抑制KDM1A介導的谷胱甘肽穩態加重冠狀動脈微栓塞所致心肌損傷
《Nature Communications》：USP16 S-nitrosylation aggravates coronary microembolization-induced myocardial injury via repressing KDM1A-mediated glutathione homeostasis
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時間：2025年12月04日
來源：Nature Communications 15.7
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本研究針對冠狀動脈微栓塞(CME)誘發心肌損傷的機制展開深入探索，發現USP16在C731位點的S-硝基化(SNO)通過抑制其對KDM1A的去泛素化作用，導致KDM1A蛋白降解，進而影響KDM1A對GCLM和GLS的表觀遺傳調控，破壞谷胱甘肽(GSH)穩態，最終加劇CME誘導的心肌損傷。該研究揭示了CME進程中氧化應激調控的新機制，為臨床干預提供了潛在靶點。
在心血管疾病領域，冠狀動脈微栓塞(CME)是一種嚴重但常被忽視的并發癥。它可能由動脈粥樣硬化斑塊碎片自發脫落引起，也可能是經皮冠狀動脈介入治療(PCI)的并發癥。CME會導致冠狀動脈血流儲備降低、心功能不全和心律失常，是心血管不良事件的重要預測因子。目前臨床治療策略主要集中在斑塊穩定化以及使用血管擴張劑、抗血小板和抗炎藥物，但療效有限。因此，深入理解CME導致心肌損傷的分子機制，對于開發新的治療策略至關重要。
先前研究表明，谷胱甘肽(GSH)耗竭誘導的氧化應激是CME的關鍵驅動因素。GSH是細胞內最重要的抗氧化劑之一，其穩態平衡對于抵抗氧化應激損傷至關重要。GSH合成受一系列酶調控，包括谷氨酸-半胱氨酸連接酶修飾亞基(GCLM)和谷氨酰胺酶(GLS)。然而，在CME誘導的心肌損傷過程中，GSH失衡的具體調控機制尚不完全清楚。
發表在《Nature Communications》上的這項研究，由蘇強、秦姣芹、黃元等人合作完成，深入揭示了CME誘導心肌損傷的新機制：USP16的S-硝基化通過抑制KDM1A介導的GSH穩態，從而加重心肌損傷。
研究人員為開展此項研究，綜合運用了多種關鍵技術方法。研究建立了大鼠CME模型，并通過尾靜脈注射AAV9病毒實現心臟特異性基因過表達。利用超聲心動圖評估心功能，采用HE染色、HBFP染色和TUNEL染色進行組織病理學分析。體外實驗使用缺氧處理的H9c2心肌細胞和原代新生大鼠心室肌細胞(NRVMs)模擬CME。通過蛋白質印跡、免疫組化、RT-qPCR、Co-IP、ChIP等技術分析蛋白表達、互作和表觀遺傳調控。采用CCK-8法檢測細胞活力，生化法測定GSH/GSSG比值和ROS水平。通過生物素轉換實驗檢測S-硝基化水平，并利用質譜分析鑒定互作蛋白和修飾位點。
研究人員首先成功建立了大鼠CME模型。超聲心動圖顯示，CME大鼠的左心室收縮末期內徑(LVIDs)、左心室舒張末期內徑(LVIDd)、左心室收縮末期容積(LVESV)和左心室舒張末期容積(LVEDV)均增加，表明CME誘導了心臟肥大。同時，射血分數(EF)和短軸縮短率(FS)降低，表明心功能受損。血清CK-MB水平顯著升高。組織學分析顯示，CME大鼠心肌缺血區域增加，心肌細胞核溶解或缺失，伴有水腫和大量炎癥細胞浸潤，細胞凋亡增加。重要的是，CME誘導后，心肌組織中GCLM和GLS表達降低，GSH/GSSG比值下降，ROS水平升高，表明GSH穩態被破壞。
GCLM/GLS過表達恢復體外CME模型中的GSH穩態
在體外，研究人員用缺氧心肌細胞模擬CME。隨著缺氧時間延長，心肌細胞中GSH/GSSG比值和細胞活力降低，ROS水平升高。與體內結果一致，GCLM和GLS蛋白水平隨時間推移而降低，而GSS、GDH和GSR蛋白水平不受缺氧影響。在H9c2細胞和原代NRVMs中過表達GCLM或GLS，可逆轉缺氧誘導的GSH/GSSG比值降低和ROS水平升高，恢復細胞活力。這些結果表明，GCLM或GLS過表達可緩解缺氧誘導的心肌細胞GSH失衡。
KDM1A過表達減輕CME誘導的心功能不全和GSH失衡
研究人員將關注點轉向組蛋白去甲基化酶KDM1A。他們發現CME大鼠心肌組織中KDM1A表達顯著降低。通過向CME大鼠注射AAV9-KDM1A過表達KDM1A，可有效改善心功能指標，降低血清CK-MB水平，減少心肌缺血區域、微梗死面積、病理改變和細胞凋亡。同時，KDM1A過表達逆轉了CME誘導的KDM1A、GCLM和GLS蛋白表達降低，部分逆轉了GSH/GSSG比值下降和ROS水平升高。這些結果揭示，KDM1A過表達通過恢復GSH穩態，改善了CME誘導的心肌損傷。
心肌細胞中CME觸發的GSH失衡被KDM1A過表達緩解
在體外實驗中，缺氧使心肌細胞KDM1A蛋白水平呈時間依賴性下降。KDM1A過表達可增強GCLM和GLS蛋白水平，部分抵消缺氧刺激心肌細胞中GSH/GSSG比值和細胞活力的降低以及ROS水平的升高。KDM1A過表達還逆轉了缺氧刺激心肌細胞中KDM1A、GCLM和GLS蛋白水平的降低。因此，KDM1A過表達在體外CME模型中也負責維持GSH穩態。
KDM1A促進心肌細胞中GCLM和GLS的轉錄和表達
為探討KDM1A對GSH相關蛋白表達的影響，研究人員敲低了H9c2細胞和NRVMs中的KDM1A。發現只有GCLM和GLS的mRNA和蛋白水平在KDM1A敲低后明顯降低。通過生物信息學預測和ChIP實驗驗證，KDM1A可直接結合GCLM和GLS啟動子區域。KDM1A沉默后，其與GCLM和GLS啟動子的結合減弱。ChIP-re-ChIP實驗表明，KDM1A缺失抑制了心肌細胞中GCLM和GLS啟動子上去除H3K9me1/2。綜上所述，KDM1A直接結合GCLM和GLS啟動子，通過去除H3K9me1/2促進其轉錄和表達。
鑒于KDM1A蛋白表達在CME中降低，研究人員進一步探討了其具體機制。發現蛋白酶體抑制劑MG132而非自噬抑制劑CQ可部分逆轉缺氧誘導的KDM1A下調，表明KDM1A通過泛素-蛋白酶體系統而非自噬降解。Co-IP顯示，缺氧刺激的心肌細胞中KDM1A泛素化水平呈時間依賴性增加。CME大鼠心肌組織中KDM1A蛋白泛素化水平也增強。通過質譜分析篩選出KDM1A潛在的E3泛素連接酶和去泛素化酶，發現USP16(去泛素化酶)和RNF138(E3泛素連接酶)是候選分子。缺氧使心肌細胞USP16蛋白水平呈時間依賴性降低，而不影響RNF138蛋白水平。USP16敲低降低KDM1A蛋白水平，而RNF138敲低增強KDM1A蛋白水平。Co-IP驗證了KDM1A與USP16/RNF138蛋白的外源性和內源性相互作用。在正常條件下，KDM1A傾向于結合USP16而非RNF138，這在缺氧條件下被逆轉。因此，缺氧刺激下RNF138介導的泛素化導致KDM1A蛋白降解。
為進一步鑒定KDM1A蛋白的特異性泛素化位點，通過質譜分析篩選出K355位點。Co-IP實驗顯示，在缺氧條件下，KDM1A-K355R組的KDM1A泛素化水平低于KDM1A-WT組。USP16敲低增強了缺氧刺激的H9c2細胞中KDM1A-WT組的KDM1A泛素化水平，而在KDM1A-K355R組中這種效應被消除。K355位點突變增強了H9c2細胞中的GSH/GSSG比值和細胞活力，降低了ROS水平。USP16缺失降低了KDM1A-WT轉染的H9c2細胞的GSH/GSSG比值和細胞活力，增加了ROS水平，而這些變化在K355位點突變后被消除。USP16敲低降低了缺氧暴露的H9c2細胞KDM1A-WT組中KDM1A、GCLM和GLS的蛋白水平，但不影響KDM1A-K355R組。這些結果證明USP16抑制KDM1A蛋白在K355位點的泛素化。
抑制C731位點的SNO-USP16改善CME模型中的GSH穩態
S-硝基化(SNO)是一種基于氧化還原的蛋白質修飾，調節多種酶的生物學功能。生物素轉換實驗顯示，CME大鼠心肌組織中SNO-USP16水平顯著高于假手術組。缺氧刺激的心肌細胞中SNO-USP16水平也升高。GPS-SNO數據庫預測USP16可能在C731位點發生S-硝基化，該位點在人類、小鼠和大鼠中高度保守。缺氧導致USP16-WT轉染的心肌細胞中SNO-USP16水平升高，而在C731突變體中被消除。缺氧刺激心肌細胞中降低的GSH/GSSG比值和細胞活力以及升高的ROS水平被C731位點突變逆轉。USP16-WT轉染在缺氧條件下下調了KDM1A、GCLM和GLS蛋白水平，這在USP16-C731A轉染的心肌細胞中被部分抵消。在體實驗中，AAV9-USP16-C731A遞送比AAV9-USP16-WT更能改善CME大鼠的心功能，減輕缺血、微栓塞和凋亡，更有效地逆轉USP16、KDM1A、GCLM和GLS表達下調，提高GSH/GSSG比值，降低ROS水平。這些發現表明C731位點的SNO-USP16參與了CME誘導的GSH失衡。
C731位點的SNO-USP16促進KDM1A泛素化
鑒于SNO-USP16有助于CME中的GSH失衡，研究人員進一步闡明了SNO-USP16是否影響KDM1A蛋白泛素化。Co-IP顯示，缺氧條件下USP16與KDM1A蛋白間的相互作用減弱，C731位點突變可恢復這種相互作用。USP16-C731A轉染或MG132處理可上調缺氧暴露心肌細胞中的KDM1A蛋白水平，而USP16-C731A轉染和MG132處理聯合應用則進一步增強這種效應。CHX追蹤實驗表明，USP16-C731A轉染延遲了缺氧刺激心肌細胞中KDM1A蛋白的降解。缺氧刺激升高的KDM1A泛素化水平在USP16-C731A轉染的心肌細胞中被消除。因此，抑制C731位點的SNO-USP16可抑制KDM1A的泛素化和降解。
iNOS介導的SNO-USP16導致CME誘導的GSH失衡和KDM1A下調
缺氧刺激促進iNOS活化，進而促進NO產生。過量的NO產生可促進多種疾病發病機制中蛋白質的S-硝基化。研究人員進一步探討了iNOS對CME背景下SNO-USP16的調控。使用iNOS抑制劑1400W處理，可有效逆轉缺氧誘導的SNO-USP16上調。缺氧條件下減弱的USP16與KDM1A之間的相互作用被1400W恢復。缺氧誘導的GSH/GSSG比值降低、細胞活力下降以及ROS水平升高被1400W部分抵消。1400W處理部分逆轉了缺氧刺激心肌細胞中USP16、KDM1A、GCLM和GLS蛋白水平的降低。在體評估iNOS抑制對CME的影響，發現1400W給藥通過增強EF和FS水平，降低血清CK-MB、LVIDd、LVIDs、LVEDV和LVESV水平，改善了CME大鼠的心功能。1400W治療減少了CME大鼠心臟的缺血區域，抑制了凋亡和微栓塞。隨后，CME大鼠心臟組織中iNOS表達升高以及USP16、KDM1A、GCLM和GLS表達降低被1400W處理消除。CME組中升高的SNO-USP16水平被1400W照射部分降低。此外，1400W處理提高了CME大鼠心臟的GSH/GSSG比值，降低了ROS水平。綜上所述，iNOS通過促進USP16的S-硝基化，降低KDM1A表達，從而損害CME中的GSH穩態。
本研究結論表明，iNOS介導的USP16在C731位點的S-硝基化，通過促進E3泛素連接酶RNF138對KDM1A蛋白K355位點的泛素化修飾，導致KDM1A經泛素-蛋白酶體途徑降解。KDM1A的下調使其無法通過去除GCLM和GLS啟動子區域的H3K9me1/2修飾來促進這兩個關鍵基因的轉錄表達，最終破壞GSH穩態，加劇CME誘導的心肌損傷。這一新機制的揭示，不僅深化了對CME病理過程的理解，更重要的是指出了USP16/KDM1A軸作為干預CME的潛在新靶點。抑制USP16的S-硝基化或增強KDM1A的穩定性，可能成為治療CME誘導的心肌損傷的新策略。
研究的創新之處在于首次揭示了USP16 S-硝基化在CME中的關鍵作用，并闡明了從iNOS激活到GSH穩態破壞的完整信號通路：iNOS↑ → SNO-USP16↑ → USP16活性↓ → KDM1A泛素化降解↑ → GCLM/GLS轉錄↓ → GSH合成↓ → 氧化應激↑ → 心肌損傷。這一通路的解析為CME的防治提供了多個可能的干預環節，具有重要的理論意義和潛在的臨床轉化價值。
該研究也存在一些局限性，例如未在基因敲除動物或臨床樣本中驗證數據；缺乏CME的體外模型，使用缺氧刺激的細胞模型可能無法完全模擬CME的所有方面；未能確定大鼠CME模型中微栓塞的確切位置等。這些局限性為未來研究提供了方向。
總之，這項研究系統地闡明了iNOS-USP16-KDM1A-GCLM/GLS軸在CME誘導心肌損傷中的重要作用，深化了對CME發病機制的理解，并為開發新的治療策略提供了重要的理論依據和潛在靶點。研究成果發表在《Nature Communications》上，體現了其重要學術價值。
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