FOXA1通過轉錄激活和表觀沉默雙重調控RBM47表達抑制結直腸癌上皮-間質轉化與轉移的機制研究

《Molecular Biomedicine》：Down-regulation of RBM47 due to diminished activation by forkhead box A1 (FOXA1) and silencing by CpG methylation is associated with epithelial-mesenchymal transition and metastasis of colorectal cancer

【字體： 大 中 小 】 時間：2025年12月05日 來源：Molecular Biomedicine 10.1

　　

在全球范圍內，結直腸癌每年導致超過90萬人死亡，成為第二大致命癌癥，其中超過90%的死亡率歸因于腫瘤轉移。令人擔憂的是，轉移性結直腸癌患者的5年生存率不足15%，這凸顯了深入理解CRC轉移機制對于改善預防和治療策略的迫切性。

在結直腸癌進展過程中，RNA結合基序蛋白47（RBM47）的表達下調是一個顯著特征。RBM47作為一種RNA結合蛋白，通過調節RNA穩定性、剪接和編輯來調控靶基因的轉錄后表達。盡管先前研究表明RBM47在乳腺癌、肺癌和結直腸癌細胞系及小鼠模型中發揮腫瘤抑制作用，但其在CRC中表達下調的具體機制及其在腫瘤進展中的功能后果尚不明確。

尤其值得注意的是，上皮-間質轉化（EMT）及其反向過程間質-上皮轉化（MET）在腫瘤轉移中扮演著關鍵角色。RBM47被發現在上皮樣癌細胞中高表達，而在間質樣癌細胞中表達降低，后者通常具有更強的侵襲和轉移能力。然而，驅動RBM47在正常上皮組織中高表達的轉錄因子以及其在癌癥進展中被抑制的機制仍有待闡明。

為了解答這些科學問題，Rokavec等研究人員在《Molecular Biomedicine》上發表了他們的最新研究成果。他們發現叉頭框A1（FOXA1）轉錄因子，一個對內胚層及其衍生上皮組織發育至關重要的調控因子，與RBM47表達呈顯著正相關。通過一系列精心設計的實驗，研究人員揭示了FOXA1直接結合RBM47啟動子區域并激活其轉錄的分子機制。

本研究主要采用了以下關鍵技術方法：利用公共數據庫（TCGA、GTEx、CCLE等）進行生物信息學分析；通過染色質免疫沉淀（ChIP）和定量PCR驗證轉錄因子結合；使用RNA干擾和誘導表達系統進行功能獲得和缺失實驗；通過蛋白質印跡、免疫熒光和qPCR分析基因表達；采用Transwell和小室實驗評估細胞遷移和侵襲能力；運用重亞硫酸鹽測序和甲基化特異性PCR（MSP）分析DNA甲基化狀態；并利用包含43對匹配樣本的臨床隊列（含肝轉移患者）進行生物標志物驗證。

Association of RBM47 down-regulation in CRCs with metastasis and poor prognosis

研究人員首先通過對12個包含584例CRC患者的隊列進行分析，發現與癌旁正常組織相比，10個隊列中RBM47在腫瘤組織中顯著下調。更重要的是，低RBM47表達與遠處轉移（M1）顯著相關。根據共識分子分型（CMS），RBM47在間質樣CMS4亞型中表達最低，該亞型患者預后最差且轉移發生率最高。通過患者來源異種移植（PDX）模型排除腫瘤微環境干擾后，研究人員發現RBM47在結直腸癌內在亞型（CRIS）-B中也呈現最低表達。生存分析進一步證實低RBM47表達與較差的無復發生存率相關。

In vivo correlation of RBM47 and FOXA1 expression

通過分析人類蛋白質圖譜數據，研究人員發現RBM47蛋白在結腸、小腸、膽囊和肺等內胚層衍生組織中表達最高�；�因型-組織表達（GTEx）項目數據分析顯示，RBM47與FOXA1表達在不同人體組織中呈顯著正相關。在14個原發性CRC和CRC細胞系隊列中，FOXA1 mRNA表達與RBM47 mRNA表達呈現一致且顯著的正相關。與RBM47類似，FOXA1在結腸癌中相較于癌旁正常組織也呈現一致下調，且在CMS4亞型中表達最低，低FOXA1表達同樣與較差預后相關。在細胞系水平，上皮樣CRC細胞系（如DLD-1、HCT15）中FOXA1和RBM47表達均高于間質樣細胞系（如SW480、SW620）。

RBM47 expression is directly induced by FOXA1

為驗證FOXA1是否直接調控RBM47表達，研究人員分析了公共基因表達 omnibus（GEO）數據庫中FOXA1過表達/敲低/敲除的數據集，發現大多數研究中RBM47 mRNA在FOXA1過表達后誘導，而在FOXA1敲低后抑制。通過預測，研究人員在RBM47基因座發現了四個推定的FOXA1結合位點。染色質免疫沉淀（ChIP）-qPCR分析證實FOXA1在DLD1和SW620細胞中能與這些位點結合。功能實驗表明，在上皮樣DLD1和HCT15細胞中敲低FOXA1可顯著抑制RBM47 mRNA和蛋白表達，而在間質樣SW480和SW620細胞中過表達FOXA1則可誘導RBM47表達。

FOXA1 induces mesenchymal to epithelial transition(MET)via up-regulation of RBM47

接下來研究人員探討了FOXA1是否通過RBM47調控EMT/MET。發現在上皮樣DLD1細胞中敲低FOXA1可誘導間質標志物ZEB1、VIM（波形蛋白）、SNAIL和SLUG的表達，同時降低上皮標志物E-鈣黏蛋白（CDH1）的表達。相反，在間質樣SW480和SW620細胞中過表達FOXA1可促進細胞從間質向上皮形態轉變，抑制VIM和SNAIL表達，誘導CDH1表達。重要的是，通過siRNA敲低RBM47可阻止FOXA1對CDH1的誘導和對VIM、SNAIL的抑制作用，表明FOXA1通過RBM47介導MET過程。

FOXA1 suppresses migration and invasion via RBM47

通過Transwell和小室實驗，研究人員發現過表達FOXA1可顯著抑制SW480和SW620細胞的遷移和侵襲能力，而敲低RBM47則增強這些細胞的遷移和侵襲。當同時過表達FOXA1并敲低RBM47時，FOXA1對遷移和侵襲的抑制作用被消除，證明FOXA1通過RBM47抑制CRC細胞的遷移和侵襲。

CpG methylation analysis of RBM47

為探究RBM47在間質樣CRC細胞系和晚期原發性CRC中持續下調的機制，研究人員分析了53個CRC細胞系中RBM47表達與DNA甲基化的關系。發現大多數上皮樣細胞系呈現高RBM47表達和低啟動子甲基化，而間質樣細胞系則顯示低RBM47表達和高啟動子甲基化，且兩者呈顯著負相關。通過重亞硫酸鹽測序和甲基化特異性PCR（MSP）驗證，發現上皮樣DLD1和HCT15細胞中RBM47啟動子區CpG位點完全非甲基化，而間質樣SW480和SW620細胞中該區域完全甲基化。用DNA甲基轉移酶抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷（5-Aza）處理可重新激活RBM47表達。

CpG methylation of RBM47 is associated with liver metastasis in CRC patients

在包含43對匹配樣本的臨床隊列中，肝轉移患者（M1）的原發性CRC顯示比無肝轉移患者（M0）更高頻率和程度的RBM47甲基化。與此一致，RBM47蛋白表達與啟動子甲基化呈顯著負相關。與之前研究的生物標志物（如MIR34a甲基化、c-MET、SNAIL和β-連環蛋白表達）相比，RBM47甲基化與轉移的關聯具有更高的比值比、敏感性和特異性。

FOXA1 and RBM47 down-regulation during CRC progression is associated with CpG methylation of RBM47

對多個CRC患者隊列的分析顯示，FOXA1和RBM47表達從1期到4期結直腸腫瘤中逐漸降低。值得注意的是，RBM47啟動子甲基化在正常組織和1期腫瘤中相似，但在更高分期腫瘤中增加，表明RBM47啟動子高甲基化并非發生在腫瘤起始階段，而是在腫瘤進展過程中。

研究結論與討論部分強調，FOXA1-RBM47軸是CRC中MET的關鍵調控因子。在正常腸上皮中，高FOXA1表達維持了RBM47的高表達。在早期CRC中，FOXA1和RBM47表達下降，而在轉移性4期CRC中，RBM47啟動子表觀遺傳沉默加劇。研究人員提出了一個模型：在早期腺瘤發生期間，FOXA1及隨之的RBM47表達下降；在腺瘤向癌進展過程中，RBM47啟動子逐漸高甲基化，將最初的RBM47下調表觀遺傳固定下來。

這一機制的重要性在于FOXA1具有打開濃縮染色質結構的能力，其招募至增強子和啟動子與DNA去甲基化和組蛋白H3K4甲基化相關，從而導致轉錄激活。相反，FOXA1敲低與FOXA1結合區域CpG甲基化增加相關。此外，FOXA1與TET1和TET2 DNA羥化酶相互作用，促進DNA去甲基化。因此，CRC腫瘤發生過程中FOXA1的下調將允許RBM47啟動子的CpG甲基化和表達抑制。

該研究還指出，RBM47表達也受其他轉錄因子調控，如SNAIL、SLUG和STAT3，表明RBM47抑制可能是FOXA1表達減少和STAT3等抑制因子激活共同作用的結果。

最重要的是，本研究確立了RBM47作為FOXA1誘導MET的必要介質，揭示了轉錄下調（由于FOXA1表達減少）和隨后表觀沉默（通過CpG甲基化）在CRC進展中的時間順序。FOXA1和RBM47的下調使得上皮樣CRC細胞轉變為更具間質樣、侵襲性的CRC細胞，最終導致轉移形成。此外，RBM47啟動子CpG高甲基化作為轉移性CRC的潛在生物標志物，為臨床診斷和治療提供了新思路。

這項研究不僅深化了對結直腸癌轉移機制的理解，也為開發新的治療策略和生物標志物提供了重要理論基礎，對改善結直腸癌患者預后具有重要臨床意義。