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KRAS G12突變體在HLA-A*11:01中的結構導向分析揭示G12D因長度編碼而具有免疫原性優勢

《Communications Biology》：Structure guided analysis of KRAS G12 mutants in HLA-A*11:01 reveals a length encoded immunogenic advantage in G12D

【字體：大中小】 時間：2025年12月05日 來源：Communications Biology 5.1

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　　本研究針對KRAS G12突變在T細胞免疫療法中響應差異的難題，通過整合結構生物學與生物物理學方法，解析了不同KRAS G12變異體（包括G12C、G12R、G12V、G12A、G12S和G12D）與HLA-A*11:01形成的pMHC復合物的構象差異。研究發現G12D肽段可呈現為9肽（VVGADGVGK）和10肽（VVVGADGVGK）兩種形式，但僅10肽能形成穩定的復合物并被TCR有效識別。該研究揭示了肽段長度和構象對免疫原性的決定性影響，為靶向KRAS G12D的TCR-T療法設計提供了關鍵理論依據。

在癌癥免疫治療領域，靶向腫瘤特異性抗原（TSAs）的過繼性T細胞療法，如嵌合抗原受體T細胞（CAR-T）和T細胞受體工程化T細胞（TCR-T），已經展現出巨大潛力。這些療法能夠精準識別由主要組織相容性復合物I類（MHC-I）分子呈現在腫瘤細胞表面的突變肽段，從而發動免疫攻擊。在眾多癌基因突變中，KRAS基因第12位甘氨酸（G12）的突變是最常見的驅動突變之一，廣泛存在于結直腸癌、胰腺癌和非小細胞肺癌等惡性腫瘤中。這些突變導致KRAS蛋白持續處于激活狀態，進而異常活化MAPK和PI3K-AKT等信號通路，促進腫瘤生長。盡管針對KRAS G12突變體的TCR-T療法已進入早期臨床試驗，但患者的臨床反應存在顯著差異，尤其是攜帶G12D突變的患者往往療效不佳。這提出了一個關鍵科學問題：為何源于同一突變位點的不同氨基酸替換，甚至同一突變（如G12D）產生的不同長度肽段，會引發截然不同的免疫識別效果？其背后的結構基礎和物理化學機制是什么？

為了回答這些問題，由同濟大學附屬普陀人民醫院麻醉科的趙林林（Linlin Zhao）和徐克（Ke Xu）作為共同通訊作者的研究團隊，在《Communications Biology》上發表了他們的最新研究成果。研究人員猜測，不同G12突變可能通過改變肽段-MHC-I（pMHC）復合物的三維構象、穩定性以及其與T細胞受體（TCR）相互作用的界面，從而影響免疫原性。特別是對于在東亞人群中高表達的HLA-A11:01等位基因，其呈現KRAS G12突變肽段的精細機制尚不清楚。因此，他們開展了一項綜合性研究，旨在從原子水平揭示KRAS G12突變如何重塑HLA-A11:01的抗原呈遞景觀。

研究人員運用了多種前沿技術來攻克這一難題。關鍵技術方法包括：利用溶液核磁共振（NMR）光譜分析pMHC復合物在溶液中的動態構象變化和結合親和力；通過X射線晶體學解析不同KRAS G12突變肽（G12C, G12R, G12V, G12A, G12S以及G12D 9肽）與HLA-A*11:01復合物的高分辨率三維結構（分辨率在1.79 ? 到 3.1 ? 之間）；采用分子動力學（MD）模擬（使用Desmond軟件包，OPLS-AA 2005力場，100 ns模擬時長）來評估G12D 9肽和10肽復合物的穩定性和結合自由能（MM/GBSA計算）；通過細胞實驗（在穩定表達特定pMHC的293T細胞系中進行環己酰亞胺（CHX）追蹤實驗）評估pMHC復合物的穩定性；以及使用流式細胞術分析工程化Jurkat T細胞（表達針對G12D 10肽的TCR）對pMHC四聚體的識別能力。

結果

溶液NMR揭示KRAS-HLA-A11:01復合物的正確折疊和骨架指認*

研究人員首先通過溶液NMR技術驗證了重構的HLA-A11:01/β₂M（β₂微球蛋白）/KRAS G12野生型10肽（VVVGAGGVGK）復合物的結構完整性。對均勻標記²H, ¹⁵N, ¹³C的HLA-A11:01重鏈進行三共振NMR實驗，完成了約75%的非脯氨酸殘基的骨架指認。譜圖顯示出良好的信號分散度，表明復合物折疊正確，無聚集。基于化學位移的二級結構預測（TALOS+）結果與已知的HLA-A晶體結構一致，證實了該重組復合物在水溶液中呈現天然構象，為后續研究奠定了可靠基礎。

NMR化學位移擾動圖譜揭示MHC溝槽中的突變特異性擾動

為了探究不同KRAS G12突變對pMHC構象的影響，研究人員將HLA-A*11:01與六種G12突變肽（G12C, G12R, G12V, G12D, G12A, G12S）分別重構復合物，并采集其¹H-¹⁵N TROSY-HSQC譜圖。與野生型復合物相比，所有突變體均引起了HLA重鏈不同程度的化學位移擾動（CSP）。值得注意的是，不同突變誘導的擾動模式具有特異性：G12C和G12R主要影響α2螺旋的外側區域；而G12V和G12D則引起更廣泛的擾動，延伸至肽結合溝的β片層底部，其中G12D的擾動最為顯著。這表明不同G12突變側鏈的性質（極性/非極性，大小，電荷）能夠獨特地重塑MHC分子的局部構象。

KRAS G12突變間不同的肽構象和MHC-I穩定性譜

通過X射線晶體學，研究人員解析了五種KRAS G12突變體（G12C, G12R, G12V, G12A, G12S）與HLA-A*11:01的復合物結構，并結合已發表的G12D 10肽結構（PDB: 7OW4）進行比較分析。結構顯示，所有肽段的N端和C端殘基在HLA的A和F口袋中的錨定模式是保守的。然而，在突變位點（第12位）附近觀察到了顯著的結構差異。G12C和G12R的側鏈朝向溶劑，而G12V、G12A、G12S和G12D的側鏈則伸入肽結合溝內部，與α2螺旋和β片層形成接觸。這種構象差異與之前的NMR CSP結果高度一致。進一步的細胞穩定性實驗（CHX追蹤）表明，與其他G12突變體相比，G12D pMHC復合物的降解速度更快，穩定性更差。

KRAS G12D中的單殘基移位重新配置HLA表位以實現選擇性TCR識別

針對G12D這一臨床挑戰，研究人員深入研究了其在HLA-A11:01背景下可被呈遞的兩種肽段：9肽（VVGADGVGK）和10肽（VVVGADGVGK）。令人驚訝的是，流式細胞術檢測發現，特異性識別G12D 10肽的TCR幾乎不與G12D 9肽 pMHC四聚體結合（結合信號不足10肽的2%）。為了揭示原因，他們解析了G12D 9肽-HLA-A11:01的晶體結構，并與G12D 10肽結構進行比較。結構對比顯示，盡管兩端錨定相似，但兩種肽段在中心區域構象迥異：在10肽中，天冬氨酸12（Asp12）側鏈向內插入結合溝；而在9肽中，Asp12側鏈朝向溶劑，且肽段中段（第4-6位殘基）發生彎曲，偏離α2螺旋朝向α1螺旋，并與HLA的Thr73形成靜電相互作用。這種表面拓撲結構的根本性差異解釋了TCR的選擇性識別。

分子動力學模擬揭示G12D 10肽相較于9肽的優越穩定性和結合親和力

分子動力學模擬為上述發現提供了能量學支持。100 ns的MD模擬顯示，G12D 10肽復合物的骨架均方根偏差（RMSD）更小，構象更穩定。MM/GBSA結合自由能計算表明，10肽與HLA-A*11:01的結合自由能（ΔG = -122.5 kcal/mol）顯著低于9肽（ΔG = -108.1 kcal/mol），表明10肽的結合更緊密、更穩定。這一結果與競爭性NMR滴定實驗相互印證：過量10肽可以競爭性置換掉與MHC結合的9肽，而反之則不能。

結論與討論

本研究通過多學科交叉的方法，系統地闡明了KRAS G12點突變如何通過改變pMHC復合物的結構、穩定性和表面拓撲來影響其免疫原性。研究的核心發現是，對于KRAS G12D突變，肽段長度是一個關鍵的免疫原性決定因素。在HLA-A*11:01的背景下，G12D 10肽能夠形成一種緊湊、穩定且其突變殘基（Asp12）埋藏于溝內的pMHC構象，這種構象能被TCR有效識別；而序列高度相似的9肽則因其彎曲的構象和溶劑暴露的Asp12，形成了截然不同的表面形貌，無法被針對10肽的TCR所識別。這種由長度編碼的構象差異得到了晶體結構、NMR滴定、分子動力學模擬和細胞功能實驗的多重驗證。

該研究的發現具有重要的理論和實踐意義。首先，它強調了在設計和篩選靶向新抗原的TCR時，不能僅關注肽段序列，還必須充分考慮其被特定HLA等位基因呈遞時所采取的具體構象（包括肽段長度和寄存器）。其次，研究揭示了KRAS G12D免疫原性相對較弱的部分結構基礎，為其靶向治療提供了新的思路。未來，基于結構的TCR工程、肽段寄存器的計算機模擬以及機器學習輔助的TCR親和力預測等策略，可以借鑒本研究提供的原子分辨率結構信息，從而更精準地靶向像KRAS G12D這樣難以對付但具有重要治療價值的共享新抗原，推動下一代個性化癌癥免疫療法的發展。

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