《Journal of Molecular and Cellular Cardiology》：Small-scale siRNA screen reveals WWC2 as a novel regulator of cardiomyocyte mitosis
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心肌細胞增殖調控機制研究：通過轉錄組比較發現WWC2通過14-3-3蛋白調控YAP磷酸化影響細胞周期退出，促進心臟再生。
Dogacan Yücel|Calvin Smith|Natalia Ferreira de Araujo|Fernando Souza-Neto|Upendra Chalise|Grace Schuler|Bayardo I. Garay|Jennifer L. Mikkila|Omar Atef Abdelhamid Mahmoud|Pratima Mandal|Rita C.R. Perlingeiro|Jop H. van Berlo
美國明尼蘇達大學綜合生物學與生理學系
摘要
總結（145字）
成年心肌細胞在出生后不久就會退出細胞周期，盡管這種變化可以通過分子干預來逆轉。為了識別新的心肌細胞增殖調節因子，我們對處于活躍增殖狀態和非增殖狀態的心肌細胞在關鍵的產前和產后發育時間點進行了比較轉錄組分析。通過整合生物信息學分析與238個差異表達基因的功能篩選，我們發現WWC2是細胞周期退出的調節因子。抑制WWC2可誘導細胞進入細胞周期并完成有絲分裂和胞質分裂，而WWC2的過表達則會促使細胞退出細胞周期。此外，抑制WWC2會導致心肌細胞去分化，表現為肌節相關基因和鈣處理基因的表達減少。從機制上看，WWC2與14-3-3蛋白結合，并調節YAP蛋白的磷酸化及表達。在體內實驗中，敲除WWC2可促進心肌梗死后的心臟再生。這些結果表明WWC2是心肌細胞周期退出和成熟過程啟動的重要調節因子。
引言
心血管疾病是全球主要的死亡原因[1]。許多心臟疾病的共同特征是心肌細胞大量丟失，從而導致心力衰竭和射血分數降低（HFrEF）[2]。成年心臟的有限再生能力是一個重大的治療挑戰，因為成熟的心肌細胞已經經歷了有絲分裂，無法在生理條件下補充丟失的心肌[3,4]。
心肌細胞從增殖狀態向有絲分裂后狀態的轉變遵循一個明確的發育軌跡[5]。雖然胚胎期的心肌細胞容易增殖，但這種能力在出生后很快就會減弱[6]。出生后早期的心肌細胞首先失去完成胞質分裂的能力，同時仍保持DNA合成能力，從而導致內復制[7]。隨后，這些細胞完全退出細胞周期，標志著它們的最終分化[5]。
最近的研究表明，分子干預可以恢復成年心肌細胞的增殖能力[[8], [9], [10], [11]]。這些增殖信號通常會引發部分去分化，表現為肌節的解體以及轉錄回類似胚胎的狀態[12,13]。這一觀察結果表明，成功使心肌細胞重新進入細胞周期需要激活發育相關程序。在這里，我們通過比較具有胞質分裂能力的胚胎期心肌細胞和胞質分裂受阻的成年心肌細胞，來識別心肌細胞增殖的關鍵調節因子。我們從這些分析中鑒定出的主要基因是WWC2（WW和C2結構域包含的蛋白2），它是一種調節Hippo信號通路的適配蛋白[14,15]。盡管在其他系統中已經發現WWC2可以通過激活Hippo通路來抑制YAP1的活性[16]，并且YAP1在胚胎和成年心臟中都是已知的心肌細胞增殖調節因子，但WWC2在心肌細胞周期活動中的直接作用尚未得到研究。
研究片段
RNA測序
對于體內RNA測序，我們按照先前的方法[30]，從胚胎第15.5天（E15.5）、出生后第1天（P1）和出生后第7天（P7）的灌注固定心臟中分離出單個心肌細胞（CMs）。分離出的CMs用抗磷酸組蛋白H3（pHH3；Abcam，ab10543）和心臟肌鈣蛋白T（TnnT；Thermo Fisher Scientific，MA5–12960）抗體以1:200的比例在4°C下染色1小時。抗體溶解在含有0.1% Triton-X和2% BSA的PBS中。
轉錄組分析揭示了發育過程中心肌細胞增殖的動態變化
為了識別新的心肌細胞（CM）增殖調節因子，我們對FACS分選的、處于活躍增殖狀態（pHH3+，即磷酸化組蛋白H3陽性）和非增殖狀態（pHH3-）的小鼠心肌細胞在三個關鍵發育階段（胚胎第15.5天（E15.5）、出生后第1天（P1）和出生后第7天（P7）進行了RNA測序（圖1A）。分選后的CMs保持了其形狀并顯示出完整的形態（補充圖1A）。我們觀察到pHH3的定位和細胞形態存在不同的染色模式。
討論
在這項研究中，我們通過比較不同發育階段（E15.5、P1和P7）活躍增殖和非增殖狀態的心肌細胞的轉錄組，旨在識別新的心肌細胞增殖調節因子。我們的分析揭示了細胞增殖過程中基因表達的動態變化，并確定WWC2是心肌細胞增殖的關鍵調節因子。轉錄組分析的一個顯著發現是上調基因的數量顯著增加。
CRediT作者貢獻聲明
Dogacan Yücel：撰寫初稿、數據可視化、方法設計、實驗設計、數據分析、概念構建。Calvin Smith：實驗設計。Natalia Ferreira de Araujo：數據可視化、實驗設計、數據分析。Fernando Souza-Neto：方法設計、實驗設計、數據分析。Upendra Chalise：數據可視化、實驗設計、數據分析。Grace Schuler：實驗設計。Bayardo I. Garay：方法設計、實驗設計。Jennifer L. Mikkila：
利益沖突聲明
作者在撰寫本手稿過程中未使用生成式AI或AI輔助技術。
致謝
本研究得到了美國國立衛生研究院（R01HL155993和R01HL160665）的支持，J.H.v.B.獲得了美國心臟協會的博士后獎學金支持。F.S.N.、U.C.、B.I.G.和J.L.M.分別得到了美國國立衛生研究院（T32HL144472、T32GM156735、T32AR007612）的資助。
