計算進化驅動的新型螺旋蛋白設計：AlphaFold2與判別網絡協(xié)同探索蛋白質折疊新空間
《Communications Chemistry》：Designing novel solenoid proteins with in silico evolution
【字體：
大
中
小
】
時間：2025年12月05日
來源：Communications Chemistry 6.2
編輯推薦：
本研究針對傳統(tǒng)螺旋蛋白設計方法效率低、難以生成特定折疊結構的問題，開發(fā)了一種結合AlphaFold2(AF2)與螺旋判別網絡SOLeNNoID的“計算進化”平臺。該研究成功從頭設計了新型α-螺旋和β-螺旋蛋白，并通過實驗驗證了其正確折疊與高穩(wěn)定性，為按需設計具有特定折疊和功能的蛋白質提供了新范式。
蛋白質是生命活動的主要執(zhí)行者，其功能很大程度上由其獨特的三維結構決定。在自然界中，存在一類結構規(guī)整、像彈簧或線圈一樣的蛋白質，被稱為螺旋蛋白（Solenoid Proteins）。它們由相似的結構單元像串珠一樣重復排列而成，根據構成單元的主要二級結構，可分為α-螺旋、β-螺旋和αβ-螺旋等類型。這類蛋白質因其模塊化的結構和延伸的表面，在DNA結合、信號傳導、抗凍等方面發(fā)揮著重要作用，同時也被認為是構建新型生物材料、納米器件和藥物的理想支架。然而，傳統(tǒng)的蛋白質設計方法耗時耗力，難以高效地創(chuàng)造出具有特定折疊方式的新型螺旋蛋白。
近年來，深度學習技術，特別是AlphaFold2 (AF2)的出現(xiàn)，徹底改變了我們對蛋白質結構預測的認識，也為蛋白質設計帶來了革命性的工具。隨之興起的“幻覺”（Hallucination）和“擴散”（Diffusion）等生成方法，能夠從頭創(chuàng)造全新的蛋白質結構。但是，這些方法在生成過程中往往缺乏對特定蛋白質折疊類型的精確控制，要么生成的結構多樣性有限，要么嚴重依賴于已知的天然結構作為模板。一個核心挑戰(zhàn)在于：我們能否像“按圖索驥”一樣，根據想要的折疊類型，直接設計出全新的、穩(wěn)定的蛋白質？特別是對于結構復雜、易于錯誤折疊和聚集的β-螺旋蛋白，其設計成功率一直很低。
為了解決這些問題，由Daniella Pretorius和James W. Murray等人組成的研究團隊在《Communications Chemistry》上發(fā)表了他們的最新研究成果。他們開發(fā)了一個名為“計算進化”（in silico evolution）的創(chuàng)新平臺，該平臺巧妙地將AF2作為結構“預言家”，與一個專門識別螺旋蛋白的深度學習網絡SOLeNNoID相結合，并通過遺傳算法來優(yōu)化蛋白質序列，從而實現(xiàn)了針對特定螺旋折疊類型的從頭設計。
研究人員采用了幾項關鍵的技術方法來驅動這項研究。核心是“計算進化”平臺，它使用遺傳算法優(yōu)化隨機起始的重復序列，以AF2預測的結構置信度（pLDDT）和SOLeNNoID判定的螺旋蛋白得分作為雙重指導進行迭代優(yōu)化。序列重新設計則依賴于蛋白質序列生成模型ProteinMPNN，以提升序列的合理性和可合成性。結構新穎性通過Foldseek進行大規(guī)模結構比對，并使用多維縮放（MDS）進行可視化分析。實驗驗證是另一大支柱，包括小規(guī)模和大規(guī)模蛋白質表達與純化（使用Ni-NTA親和層析和尺寸排阻色譜SEC）、圓二色譜（CD）分析二級結構和熱穩(wěn)定性、以及X射線晶體學來解析高分辨率結構。此外，還引入了一項名為“計算熔解”（in silico melting）的新指標，利用ESMFold評估蛋白質結構對序列擾動的魯棒性，以預測實驗成功率。對于β-螺旋蛋白，還特別采用了ProteinGenerator來設計末端封端（capping）區(qū)域，以解決其末端疏水表面暴露的問題。
研究團隊開發(fā)的計算進化平臺，其核心流程始于一個由N個長度為L的重復單元串聯(lián)而成的隨機序列。該序列的結構由AF2預測，然后由一個成本函數(shù)進行評分，該函數(shù)綜合了AF2的pLDDT置信度和SOLeNNoID網絡給出的特定螺旋類型（α、β或αβ）概率。通過遺傳算法（采用Wright-Fisher選擇策略）對序列池進行迭代優(yōu)化，直到達到預設的評分閾值。結果表明，該平臺能夠高效生成高質量的螺旋蛋白骨架，其中β-螺旋收斂速度最快，總體設計成功率高達99%。生成后的序列會進一步使用ProteinMPNN進行重新設計，以引入序列多樣性、改善物化性質，并確保其可用于基因合成。
一個關鍵問題是，該平臺是只能復現(xiàn)已知的天然螺旋結構，還是能夠創(chuàng)造真正新穎的折疊？通過將設計的螺旋蛋白結構與蛋白質數(shù)據庫（PDB）中的天然螺旋蛋白進行大規(guī)模結構比對，并利用多維縮放（MDS）進行可視化，研究人員發(fā)現(xiàn)設計的α-螺旋和αβ-螺旋蛋白不僅覆蓋了已知的結構空間，還探索了此前未被觀測到的新區(qū)域，顯示出平臺強大的創(chuàng)新潛力。然而，所有設計的β-螺旋蛋白都呈現(xiàn)出單一的右手螺旋特性，這與天然β-螺旋中左右手兼有的情況不同，暗示AF2模型對于高重復序列可能存在結構預測偏差。通過TM-score定量評估結構新穎性，約22%的α-螺旋和25%的αβ-螺旋可被視為新折疊（TM-score <0.5），而所有β-螺旋設計均與已知結構高度相似。在序列層面，通過MMseqs2與非冗余數(shù)據庫（nr）比對，絕大多數(shù)設計的序列（α-螺旋99.7%，αβ-螺旋84.5%，β-螺旋64.3%）都被認定為新穎序列（E-value >10-5），表明新骨架能夠支持與天然無關的全新序列。
研究人員從平臺生成的121個可設計骨架中，選取了24個設計（涵蓋10個不同骨架，每個骨架有3-4個MPNN重設計序列）進行實驗驗證。結果顯示，α-螺旋蛋白的表現(xiàn)最為出色：所有6個α-螺旋設計均成功克隆并表達，其中5個產生了可溶性蛋白。這5個α-螺旋蛋白在尺寸排阻色譜（SEC）中均呈現(xiàn)單一的單體峰，圓二色譜（CD）證實其具有典型的α-螺旋二級結構，并且熱穩(wěn)定性極高，在90°C下仍能保持結構。尤為重要的是，其中一個名為A_1_1的設計獲得了2.8 ?分辨率的X射線晶體結構，其Cα骨架與設計模型的RMSD僅為0.89 ?，高度一致，且序列在數(shù)據庫中無顯著同源物，證實了平臺設計全新且穩(wěn)定蛋白質的能力。與之形成鮮明對比的是，第一輪測試中的所有αβ-螺旋和β-螺旋設計均未能獲得單分散的SEC峰或正確的CD譜圖，實驗成功率為0，突顯了設計β-鏈占主導的蛋白質的巨大挑戰(zhàn)。
鑒于第一輪實驗中高AF2置信度設計仍遭遇失敗，研究團隊回顧性分析了多種計算指標預測實驗成敗的能力。他們發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)的AF2或ESMFold質量指標（如pLDDT, pAE）在區(qū)分成功與失敗的設計上效果不彰。然而，新引入的“計算熔解”指標——即結構在ESMFold預測中能耐受的序列掩碼比例的中值（Succ50）——顯示出顯著差異。成功設計的Succ50值顯著高于失敗設計。這表明，對序列擾動具有更強魯棒性的結構，其實驗成功的可能性更高。此外，與天然蛋白質的結構相似性（TM-score）也是一個有顯著性的指標，但區(qū)分度較小。
針對初始β-螺旋設計的失敗，研究人員推測缺乏有效的末端封端是導致其不穩(wěn)定和聚集的關鍵原因。他們開發(fā)了一個新的流程，使用ProteinGenerator為已有的β-螺旋骨架專門設計N端和C端封端區(qū)域。在應用了更嚴格的過濾標準（包括Succ50 >71%）后，他們選取了17個帶封端的β-螺旋設計進行實驗。結果取得了重要突破：7個設計表達了可溶性蛋白，其中兩個設計（Bcap_8_1和Bcap_8_2）的CD譜圖顯示出典型的β-鏈二級結構，并且熱穩(wěn)定性高達90°C。雖然晶體結構未能最終解析，但其能形成晶體本身是蛋白質正確折疊的有力佐證。這使得β-螺旋設計的實驗成功率從0%（0/12）提升到了12%（2/17）。
本研究成功開發(fā)并驗證了一種基于計算進化的蛋白質設計新方法，能夠特異性地從頭生成具有預定折疊類型的螺旋蛋白。該工作不僅證明了幻覺方法在可控蛋白質設計中的有效性，特別是對于α-螺旋蛋白取得了很高的實驗成功率，還深刻揭示了當前AI設計工具在應對β-鏈主導蛋白質時所面臨的挑戰(zhàn)，如AF2可能存在的結構預測偏差和β-蛋白固有的折疊難題。通過引入末端封端設計和“計算熔解”等新型過濾指標，研究為改善β-蛋白設計提供了可行的解決方案。這項研究標志著我們在向著根據特定功能需求“定制”蛋白質的終極目標邁進了一大步，為未來設計更復雜、功能化的新型蛋白質材料與工具奠定了堅實的基礎。
生物通微信公眾號
生物通新浪微博
今日動態(tài) |
人才市場 |
新技術專欄 |
中國科學人 |
云展臺 |
BioHot |
云講堂直播 |
會展中心 |
特價專欄 |
技術快訊 |
免費試用
版權所有 生物通
Copyright© eBiotrade.com, All Rights Reserved
聯(lián)系信箱：
粵ICP備09063491號
