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Nature：RFdiffusion2人工智能平臺實現高效從頭酶設計新突破

《Nature》：Computational design of metallohydrolases

【字體：大中小】 時間：2025年12月05日 來源：Nature 48.5

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　　本研究針對環境污染物降解缺乏高效催化酶的難題，開發了RFdiffusion2人工智能平臺，通過量子化學計算獲得的活性位點幾何構型直接設計鋅金屬水解酶。實驗驗證顯示最優設計ZETA_1的催化效率(kcat/KM)達16,000 M-1s-1，較既往設計提升三個數量級，晶體結構證實設計模型與實驗結構高度吻合。該技術實現了無需實驗優化的零樣本高效酶設計，為定制化生物催化劑開發開辟了新途徑。

隨著人類活動產生的環境污染問題日益嚴重，開發高效降解污染物的生物催化劑成為當務之急。自然界中，金屬水解酶能夠催化一些最具挑戰性的水解反應，它們利用結合的金屬離子激活水分子，使其能夠切割底物分子中的化學鍵。然而，對于許多新型污染物，自然界尚未演化出相應的高效水解酶。傳統蛋白質工程方法雖然能夠擴展金屬水解酶的底物范圍，但通常需要初始的底物混雜活性，且往往需要經過大量的定向進化才能達到天然酶的活性和效率水平。

在《自然》雜志最新發表的研究中，由David Baker教授領導的研究團隊報道了一種革命性的人工智能驅動酶設計方法。該研究團隊開發了RFdiffusion2這一新一代生成式人工智能流程匹配模型，能夠直接從量子化學計算獲得的活性位點構型出發，設計出具有高效催化活性的鋅金屬水解酶。這一突破標志著計算酶設計領域邁入了新紀元，為定制化生物催化劑的開發提供了強大工具。

研究團隊采用了幾項關鍵技術方法：首先基于密度泛函理論(DFT)計算構建反應過渡態理論酶模型(theozyme)；利用RFdiffusion2進行原子級亞結構支架生成，實現了序列位置和側鏈旋轉異構體不可知的酶設計；通過ProteinMPNN進行序列設計，并利用AlphaFold2進行結構預測驗證；采用PLACER深度神經網絡評估活性位點預組織程度；最后通過X射線晶體學解析蛋白質三維結構。

RFdiffusion2的技術創新與優勢

傳統的RFdiffusion方法需要預先指定催化殘基的序列位置和骨架坐標，這嚴重限制了采樣空間。即使對側鏈χ角χ1、χ2和骨架扭轉角進行相對粗糙的采樣，完整催化位點的側鏈構象和序列排列也有約10¹⁸種可能選擇。RFdiffusion2通過兩大關鍵創新解決了這一瓶頸：一是原子級亞結構支架能力，只需指定與反應過渡態相互作用的關鍵官能團位置，而非完整的側鏈和骨架構象；二是序列位置不可知支架能力，無需預先指定基序殘基的序列位置。

RFdiffusion2用流匹配(flow matching)替代擴散過程，在訓練過程中提供隨機選擇的天然原子坐標（不含序列位置信息），從而實現了序列位置不可知的原子亞結構支架。如圖1所示，RFdiffusion2能夠圍繞固定的催化官能團位置和底物坐標直接生成多樣化的蛋白質結構，讓模型自行解析未知的自由度（催化殘基的序列位置和側鏈旋轉異構體構象）。

第一輪設計驗證與ZETA_1的特征

研究團隊以熒光酯底物4-甲基傘形酮苯乙酸酯(4MU-PA)的水解為目標反應，通過DFT計算確定了Zn(II)-OH親核攻擊決定步驟的過渡態幾何結構。從5,120個RFdiffusion2推理軌跡中，研究人員篩選出96個設計進行實驗驗證。

實驗結果令人振奮：五個設計(A1、A8、B9、C4和F7)顯示出顯著高于背景的活性。其中最優設計A1（命名為ZETA_1）的催化效率(k_cat/K_M)達到16,000±2,000 M^-1s^-1，比先前設計的金屬水解酶(3-60 M^-1s^-1)高出三個數量級。ZETA_1還表現出良好的穩定性，能夠完成至少1,000次催化循環。

結構分析表明，ZETA_1與已知蛋白質結構差異顯著，在蛋白質數據庫(PDB)和AlphaFold結構數據庫(AFDB)中最相似結構的TM分數分別為0.41和0.49，且沒有類似的催化殘基排列。AlphaFold2預測其無底物結構與設計模型高度一致，PLACER評估顯示ZETA_1的活性位點高度預組織，催化側鏈固定在適當位置，底物緊密保持在設計位置。

活性位點機制與突變驗證

ZETA_1的活性位點由一個主要疏水的口袋組成，三個組氨酸通過Nε原子配位Zn(II)離子，一個天冬氨酸作為潛在的廣義堿，一個天冬酰胺與香豆素環形成氫鍵。與生成ZETA_1使用的原始理論酶模型一致，Zn(II)離子還充當氧陰離子空穴，穩定過渡態中發展的負電荷。

鋅滴定實驗測得Zn(II)的解離常數(K_D)為41±5 nM，與先前設計的金屬蛋白相似。突變實驗驗證了各個催化殘基的功能：同時突變三個金屬配位組氨酸殘基為丙氨酸(H118A/H130A/H134A)以及其中兩個單點突變(H118A/H134A)完全消除了酶活性。將第三個Zn(II)配位殘基突變為丙氨酸(H130A)導致k_cat/K_M僅下降13倍，而 proposed 廣義堿D67突變為丙氨酸對k_cat/K_M影響很小，但增加了Zn(II)結合親和力。這些結果表明H130和D67可能存在競爭性Zn(II)結合位點。

第二輪設計優化與效率提升

基于第一輪研究的啟示，團隊從包含催化堿基的新DFT理論酶出發，使用在更大數據集上訓練的RFdiffusion2新版本生成蛋白質結構。通過Chai-1對蛋白質-Zn(II)-底物磷酸酯復合物的預測評估，篩選出活性位點高度預組織的設計。

第二輪設計的成功率顯著提高：96個設計中，85個成功表達且可溶，11個涵蓋3種不同折疊的設計具有顯著的鋅依賴性4MU-PA水解活性。其中5個設計的k_cat/K_M大于10⁴M^-1s^-1，6個大于10³M^-1s^-1。最優設計ZETA_2的k_cat/K_M達到53,000±5,000 M^-1s^-1，k_cat為1.5±0.1 s^-1；ZETA_3的k_cat/K_M為19,000±2,000 M^-1s^-1；ZETA_4的k_cat/K_M為1,100±200 M^-1s^-1。

晶體結構驗證設計準確性

研究團隊解析了最活躍設計ZETA_2的晶體結構（PDB:9PYJ），3.5?分辨率的實驗結構與設計模型高度一致，骨架Cα原子均方根偏差(r.m.s.d.)為1.1?，催化殘基以設計的幾何構型預組織。結合口袋與設計模型中的過渡態高度互補。在Zn(II)浸泡后解析的2.1?結構(PDB:9PYL)也顯示骨架與設計模型近乎疊加(Cα r.m.s.d.=0.8?)，Zn(II)離子100%占據設計位置。

研究意義與未來展望

本研究證明了RFdiffusion2能夠直接從量子化學計算獲得的活性位點構型生成高活性金屬水解酶。零樣本設計出催化效率超過10⁴M^-1s^-1的酶（ZETA_1），且無需實驗優化即達到這一活性水平，是從頭酶設計領域的重大突破。第二輪設計中又成功獲得三個高效酶（ZETA_2、ZETA_3和ZETA_4），進一步證明了該設計策略的穩健性。

ZETA_1-4的結構彼此差異顯著，且與已知結構不同，其催化效率已達到天然金屬水解酶對類似底物的典型范圍(10⁴-10⁶M^-1s^-1)，且優于所有先前設計的未經優化的金屬水解酶。實驗表征強有力地證明它們按照設計機制發揮作用：利用結合的Zn(II)離子激活水分子進行親核攻擊，并穩定產生的氧陰離子中間體和過渡態。

PLACER和Chai-1集合預測表明，獲得超過10⁴M^-1s^-1的k_cat/K_M的關鍵在于底物相對于激活水和Zn(II)離子的精確定位。未來的金屬水解酶設計若能：(1)定位廣義堿使其不能重新配置與結合金屬離子相互作用；(2)更好地預組織金屬結合殘基；(3)引入額外的側鏈氧陰離子穩定，有望將活性提升至與最活躍天然金屬水解酶相當的水平。

RFdiffusion2-PLACER設計方法相比先前從頭酶設計方法具有多重優勢，應能廣泛應用于多種化學反應的高效催化劑開發。通過直接支架側鏈官能團，而非RFdiffusion1.27所需的骨架N-Cα-C=O坐標，RFdiffusion2避免了顯式枚舉催化側鏈旋轉異構體構象和沿線性序列放置催化殘基的需要，使每個設計軌跡能夠從巨大可能性空間中采樣。結合PLACER和Chai-1評估活性位點預組織和底物-過渡態定位，被證明能有效識別最活躍的設計，這一方法與在從頭設計的絲氨酸水解酶和逆醛縮酶中的類似觀察結果表明，PLACER及相關深度學習方將在設計排名中發揮廣泛作用。

這項研究不僅為環境污染物降解提供了潛在的高效生物催化劑，更開創了人工智能驅動酶設計的新范式，標志著計算生物學在解決實際化學挑戰方面邁出了重要一步。隨著這些工具的廣泛應用，預計將加速定制化生物催化劑的發展，為可持續化學和生物技術開辟新的可能性。

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