生物固體改良土壤中抗生素抗性基因、毒力因子與ESKAPE病原體的縱向宏基因組解析

《npj Antimicrobials and Resistance》：Longitudinal replicated metagenomic analysis of biosolids-amended soils reveals enrichment of ARGs, virulence factors, and ESKAPE pathogens

【字體： 大 中 小 】 時間：2025年12月05日 來源：npj Antimicrobials and Resistance

　　

在全球抗生素耐藥性危機被稱作“沉默大流行”的背景下，污水處理廠作為抗生素耐藥菌（ARB）和抗生素抗性基因（ARGs）的重要匯集的與傳播樞紐，其產生的生物固體（biosolids）在農業土壤中的再利用引發廣泛關注。盡管生物固體能提升土壤肥力，但其中富集的ARGs、毒力因子（Virulence Factors, VFs）及臨床相關病原體可能通過土壤-作物系統進入食物鏈，對公共健康構成潛在威脅。然而，以往研究多聚焦于生物固體本身或短期效應，缺乏對作物生長過程中土壤微生物組和抗性組動態變化的縱向、重復性評估。為此，由俄勒岡州立大學Tala Navab-Daneshmand團隊主導的研究，通過溫室控制實驗結合宏基因組學技術，首次系統揭示了生物固體施用對胡蘿卜栽培土壤中微生物群落結構、ARGs多樣性、VFs分布及ESKAPE病原體（包括糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌和腸桿菌屬）富集行為的持續影響，相關成果發表于《npj Antimicrobials and Resistance》。

關鍵方法概述

研究采用溫室盆栽實驗設計，以未施用生物固體的原始土壤為對照，設置生物固體改良組（70 g/kg土壤），種植胡蘿卜并持續11周。在種植前（第0周）、生長中期（第6周）和收獲期（第11周）分別采集土壤樣本（每組3重復）。通過 shotgun 宏基因組測序（Illumina HiSeq 3000平臺）對樣本DNA進行分析，使用Kaiju進行微生物分類學注釋，ARGs-OAP v2.0流程注釋ARGs亞型，VFDB數據庫注釋毒力因子，并利用Bray-Curtis距離、PERMANOVA和網絡分析（Spearman相關性）評估群落差異及微生物-ARGs共現關系。

研究結果

微生物群落多樣性及組成

生物固體改良顯著提升了土壤微生物物種豐富度（p < 0.001），但Shannon指數無顯著變化，說明 taxa 數量增加而均勻度降低。Bacteroidetes門在改良組中持續富集，而Proteobacteria在兩組中均為最優勢門。在屬水平上，生物固體施用初期（第0周）顯著富集了Dechloromonas、Sulfuritalea等與人類微生物組相關的類群；至收獲期，Rhodanobacter、Dyella和Thermomonas在改良組中仍保持較高豐度，而Ralstonia、Gemmatirosa等在原始土壤中更豐富。Bray-Curtis分析顯示兩組微生物群落結構差異顯著（PERMANOVA, p < 0.001）。

抗生素抗性基因（ARGs）譜系與多樣性

生物固體改良土壤的ARGs亞型豐富度（165種）顯著高于原始土壤（98種）（p < 0.001），且抗性組結構差異顯著（PERMANOVA, p < 0.001）。多重耐藥基因最為普遍，其次為萬古霉素、桿菌肽、磷霉素和磺胺類抗性基因。改良組中磺胺類（sul1、sul2）、四環素類（tetC、tetX₂）、磷霉素（rosA、rosB）和大環內酯類（ermF）抗性基因持續富集，而萬古霉素抗性基因在原始土壤中更高。隨時間推移，改良組ARGs優勢亞型從bacA、sul1和qacEΔ1轉變為mexF、rosA及多重耐藥轉運基因。

毒力因子（VFs）譜系與多樣性

生物固體改良顯著提升了VFs的Shannon指數（4.11 ± 0.05 vs. 3.72 ± 0.05）和豐富度（110.9 ± 8.2 vs. 64.1 ± 4.9）（p < 0.001），且VFs組成差異顯著（PERMANOVA, p < 0.001）�？傆嬜⑨尩�285種VFs，改良組中VFs多樣性在整個實驗期間維持較高水平。

ESKAPE病原體譜系

所有六種ESKAPE病原體在生物固體改良組中的相對豐度均顯著高于原始土壤（0.015 ± 0.003% vs. 0.007 ± 0.001%, p < 0.01），且富集效應持續至收獲期。其中，鮑曼不動桿菌（3.41倍）和銅綠假單胞菌（2.64倍）富集程度最高，金黃色葡萄球菌（1.56倍）和腸桿菌屬（1.39倍）亦顯著增加。

微生物組與抗性組的關聯

網絡分析顯示，原始土壤中微生物屬（如Solitalea、Sulfuriferula）與tetO（四環素抗性）等ARGs存在顯著共現（p < 0.01）；改良組中則形成更大的微生物-ARGs關聯集群，包括Bacteroidota、Pseudomonadota門類群與β-內酰胺酶基因（如oxa17）等的共現。盡管多數共現類群豐度較低（<0.1%），但其可能作為ARGs傳播的潛在載體。

結論與討論

本研究通過縱向重復的宏基因組分析，證實生物固體施用可持久改變土壤微生物群落結構，顯著富集ARGs、VFs及ESKAPE病原體，且這些效應在作物生長期間持續存在。網絡分析提示了ARGs與特定微生物類群（如Bacteroidota）的潛在宿主關系，增加了耐藥性通過水平基因轉移擴散的風險。盡管ESKAPE病原體絕對豐度較低，但其與ARGs、VFs的共存可能提升臨床耐藥性傳播的潛在危害。研究結果強調了生物固體農業應用對土壤抗性組和病原體庫的長期影響，呼吁建立整合廢水-土壤-作物的監測體系，以優化生物固體管理策略并保障環境與公共健康安全。未來需通過長周期田間研究、移動基因組（mobileme）分析及功能驗證，進一步解析ARGs的宿主歸屬和傳播機制。