無(wú)血清CHO培養(yǎng)中麥芽糖代謝新機(jī)制：溶酶體酸性α-葡萄糖苷酶的關(guān)鍵作用
《Scientific Reports》：Maltose metabolism in serum free CHO culture involves lysosomal acid α-glucosidase
【字體：
大
中
小
】
時(shí)間：2025年12月05日
來(lái)源：Scientific Reports 3.9
編輯推薦：
本研究針對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中碳水化合物來(lái)源單一的問(wèn)題，系統(tǒng)探討了麥芽糖在CHO-K1細(xì)胞中的代謝機(jī)制。研究人員通過(guò)同位素標(biāo)記、基因敲除和酶抑制劑實(shí)驗(yàn)，首次證實(shí)溶酶體酸性α-葡萄糖苷酶（GAA）介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)麥芽糖水解是其代謝關(guān)鍵途徑。該發(fā)現(xiàn)為優(yōu)化生物制藥細(xì)胞培養(yǎng)工藝提供了新策略，有望通過(guò)麥芽糖補(bǔ)充實(shí)現(xiàn)細(xì)胞高密度培養(yǎng)和重組蛋白產(chǎn)量提升。
在生物制藥領(lǐng)域，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO）細(xì)胞是生產(chǎn)重組治療性蛋白的主要宿主細(xì)胞。傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)工藝中，葡萄糖作為主要碳源易引發(fā)乳酸積累，導(dǎo)致培養(yǎng)環(huán)境酸化并限制細(xì)胞生長(zhǎng)密度。近年來(lái)，研究者發(fā)現(xiàn)二糖類(lèi)物質(zhì)麥芽糖能作為替代碳源支持哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)，但其在CHO細(xì)胞中的具體代謝機(jī)制尚不明確。發(fā)表于《Scientific Reports》的這項(xiàng)研究，首次揭示了溶酶體酸性α-葡萄糖苷酶（GAA）在CHO細(xì)胞麥芽糖代謝中的核心作用，為優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)工藝提供了全新視角。
研究團(tuán)隊(duì)采用多組學(xué)聯(lián)用技術(shù)開(kāi)展機(jī)制探索：通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）分析13C標(biāo)記麥芽糖的代謝流向；利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建GAA基因敲除（KO）細(xì)胞株；結(jié)合Western blot驗(yàn)證蛋白表達(dá)；采用酶抑制劑（卡斯塔堿/阿卡波糖）進(jìn)行功能驗(yàn)證。所有實(shí)驗(yàn)均使用ATCC來(lái)源的CHO-K1細(xì)胞株在無(wú)血清化學(xué)限定培養(yǎng)基中進(jìn)行。
生長(zhǎng)和細(xì)胞內(nèi)二糖譜分析
在含4 g/L葡萄糖的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補(bǔ)充10 g/L麥芽糖或海藻糖，發(fā)現(xiàn)麥芽糖組細(xì)胞密度在96小時(shí)達(dá)到1×107cells/mL，顯著高于海藻糖組。細(xì)胞內(nèi)二糖檢測(cè)顯示，海藻糖在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)累積至1400 μM，而麥芽糖濃度在48小時(shí)達(dá)峰值（108 μM）后下降，表明麥芽糖被主動(dòng)代謝。
添加13C標(biāo)記麥芽糖后，乳酸中13C-[M+3]同位素體比例在96小時(shí)升至6.6%，TCA循環(huán)中間體（檸檬酸、琥珀酸、蘋(píng)果酸）均檢測(cè)到13C標(biāo)記。而13C-海藻糖組標(biāo)記率不足1%，證實(shí)麥芽糖能通過(guò)水解生成葡萄糖參與能量代謝。
使用細(xì)胞膜通透性GAA抑制劑卡斯塔堿（26.4 μM）時(shí)，麥芽糖適應(yīng)型CHO細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率達(dá)37.5%，非通透性抑制劑阿卡波糖無(wú)此效應(yīng)，提示麥芽糖水解發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)。
GAA-KO細(xì)胞在麥芽糖培養(yǎng)基中細(xì)胞內(nèi)麥芽糖積累量為野生型的3-6倍，且細(xì)胞生長(zhǎng)受阻。回補(bǔ)GAA基因后，細(xì)胞內(nèi)麥芽糖水平下降至對(duì)照組的20%，細(xì)胞密度恢復(fù)至3.4×106cells/mL。
轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)力學(xué)特征
在0-40 g/L麥芽糖濃度范圍內(nèi)，GAA-KO細(xì)胞的麥芽糖攝取速率呈線性增長(zhǎng)（R2>0.98），未出現(xiàn)飽和動(dòng)力學(xué)特征，提示可能存在高容量轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。
本研究通過(guò)多維度實(shí)驗(yàn)證實(shí)：麥芽糖通過(guò)未知轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入CHO細(xì)胞后，由溶酶體酸性α-葡萄糖苷酶（GAA）水解為葡萄糖參與能量代謝。該機(jī)制解析了麥芽糖延長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)周期、提高抗體產(chǎn)量的生理基礎(chǔ)，為開(kāi)發(fā)二糖補(bǔ)充型無(wú)血清培養(yǎng)基提供了理論支撐。針對(duì)GAA的代謝工程改造有望成為優(yōu)化生物工藝的新突破口。
生物通微信公眾號(hào)
生物通新浪微博
- 搜索
- 國(guó)際
- 國(guó)內(nèi)
- 人物
- 產(chǎn)業(yè)
- 熱點(diǎn)
- 科普
今日動(dòng)態(tài) |
人才市場(chǎng) |
新技術(shù)專(zhuān)欄 |
中國(guó)科學(xué)人 |
云展臺(tái) |
BioHot |
云講堂直播 |
會(huì)展中心 |
特價(jià)專(zhuān)欄 |
技術(shù)快訊 |
免費(fèi)試用
版權(quán)所有 生物通
Copyright© eBiotrade.com, All Rights Reserved
聯(lián)系信箱：
粵ICP備09063491號(hào)
