基于CryoCapsule-HPM Liveμ-R221聯(lián)用的活細(xì)胞至電鏡三維相關(guān)成像技術(shù)：實(shí)現(xiàn)內(nèi)吞體動(dòng)態(tài)追蹤的新突破

《Scientific Reports》：Combining the CryoCapsule, HPM live μ and R221 conductive resin to track endosome from live imaging to electron microscopy using high-pressure freezing

【字體： 大 中 小 】 時(shí)間：2025年12月05日 來源：Scientific Reports 3.9

　　

在生命科學(xué)領(lǐng)域，將動(dòng)態(tài)的活細(xì)胞信息與高分辨率的電子顯微鏡圖像進(jìn)行關(guān)聯(lián)，一直是科學(xué)家們追求的目標(biāo)。相關(guān)光鏡和電子顯微鏡（CLEM）技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，它試圖彌合不同成像尺度之間的鴻溝，讓研究人員能夠先觀察活細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)事件，然后再在電鏡下精確定位同一結(jié)構(gòu)的超微細(xì)節(jié)。然而，這條路充滿挑戰(zhàn)。其中一個(gè)關(guān)鍵難點(diǎn)在于，如何在不破壞細(xì)胞生理狀態(tài)的前提下，將活細(xì)胞觀察后的樣品瞬間“凍結(jié)”在接近自然的狀態(tài)，以便進(jìn)行后續(xù)的電鏡制樣。傳統(tǒng)的化學(xué)固定方法會(huì)引入人工假象，而物理冷凍固定，特別是高壓冷凍（High-Pressure Freezing, HPF）技術(shù)，雖能更好地保存樣品的超微結(jié)構(gòu)，但其操作復(fù)雜，且難以與活細(xì)胞成像無(wú)縫銜接。

早期的嘗試，如Paul Verkade在2008年提出的方法，展示了活細(xì)胞觀察后快速進(jìn)行高壓冷凍的潛力，但并未成為常規(guī)技術(shù)，主要受限于手動(dòng)操作的不穩(wěn)定性、樣品損傷風(fēng)險(xiǎn)以及成功率低等問題�；罴�(xì)胞成像后到高壓冷凍之間的時(shí)間延遲可能使捕獲的瞬間失去生理意義，而高壓冷凍過程中高達(dá)2000巴的液氮沖擊流極易導(dǎo)致樣品位移甚至載體（如藍(lán)寶石片）破裂。此外，如何在電鏡水平精準(zhǔn)找回活細(xì)胞中觀察到的特定結(jié)構(gòu)，尤其是像內(nèi)吞體（endosome）這樣快速移動(dòng)的細(xì)胞器，更是難上加難。

為了解決這些長(zhǎng)期存在的技術(shù)瓶頸，Heiligenstein團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了一項(xiàng)系統(tǒng)性革新。他們重新設(shè)計(jì)了整個(gè)技術(shù)體系，從樣品載體、高壓冷凍設(shè)備到包埋樹脂，旨在將活細(xì)胞-HPF-CLEM（Live-HPF-CLEM）從一種高難度的嘗試轉(zhuǎn)變?yōu)槌Ｒ?guī)、可靠的研究流程。他們的研究成果發(fā)表在《Scientific Reports》上，展示了如何成功追蹤活細(xì)胞中快速運(yùn)動(dòng)的內(nèi)吞體，并在電鏡水平以高置信度將其找回進(jìn)行三維觀察。

關(guān)鍵技術(shù)方法

本研究的核心是三項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)的整合應(yīng)用。首先是CryoCapsule樣品載體，它是一個(gè)由兩個(gè)藍(lán)寶石圓片和間隔環(huán)組成的透明容器，允許細(xì)胞在生理?xiàng)l件下培養(yǎng)和成像，并能承受高壓冷凍的沖擊。研究人員通過計(jì)算優(yōu)化了藍(lán)寶石的厚度（100 μm）和腔體直徑（1 mm），在保證良好熱傳導(dǎo)性和機(jī)械強(qiáng)度的同時(shí)，將形變降至納米級(jí)別（23 nm）。其次是HPM Liveμ高壓冷凍儀，它將光學(xué)顯微鏡與高壓冷凍儀集成，通過機(jī)械臂實(shí)現(xiàn)樣品從成像位置到冷凍腔體的自動(dòng)轉(zhuǎn)移，將可靠轉(zhuǎn)移時(shí)間從手動(dòng)操作的約1分鐘縮短至1.26秒。針對(duì)高倍鏡成像時(shí)的振動(dòng)問題，團(tuán)隊(duì)還開發(fā)了專用高分辨率載物臺(tái)以穩(wěn)定圖像。最后是R221導(dǎo)電樹脂，這是一種新型包埋介質(zhì)，具有良好的導(dǎo)電性，即使在冷凍置換（Freeze-Substitution）過程中使用低濃度醋酸鈾酰（如0.05%）進(jìn)行輕微染色，也能在體積電子顯微鏡（如陣列斷層掃描成像，Array Tomography）中獲得足夠?qū)Ρ榷�，同時(shí)在一定程度上保留了樹脂內(nèi)熒光（In-Resin Fluorescence）的可能性，有助于后續(xù)關(guān)聯(lián)定位。

研究結(jié)果

工作流程的可靠性

團(tuán)隊(duì)首先驗(yàn)證了整套工作流程的穩(wěn)定性和樣品回收率。他們?cè)贑ryoCapsule中培養(yǎng)穩(wěn)定表達(dá)Tau-GFP（標(biāo)記微管）的SY5Y-SH細(xì)胞，在集成顯微鏡下進(jìn)行活體成像（5x, 10x, 20x）后觸發(fā)高壓冷凍。結(jié)果表明，在樣品制備未受損的情況下，細(xì)胞在轉(zhuǎn)移和冷凍過程中沒有發(fā)生丟失或位移。經(jīng)過冷凍置換和EPON 812或R221樹脂包埋后，通過超薄切片和透射電鏡（TEM）成像，成功找回了所有目標(biāo)細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了100%的細(xì)胞回收率。低倍電鏡圖像與活細(xì)胞成像地圖能夠精確匹配，證明了從活細(xì)胞觀察到電鏡定位整個(gè)流程的可靠性。

應(yīng)用于動(dòng)態(tài)生物結(jié)構(gòu)：完整CLEM工作流程的高時(shí)空分辨率

為了挑戰(zhàn)更具動(dòng)態(tài)性的結(jié)構(gòu)，研究人員選擇追蹤黑色素細(xì)胞（MNT1細(xì)胞系）中由內(nèi)源性表達(dá)的Syntaxin-13-GFP標(biāo)記的內(nèi)吞體。利用高分辨率載物臺(tái)，他們?cè)?0倍空氣物鏡下以10秒間隔追蹤內(nèi)吞體運(yùn)動(dòng)長(zhǎng)達(dá)1分鐘，然后在不到2秒內(nèi)完成高壓冷凍。樣品經(jīng)過含微量醋酸鈾酰（0.05%）和水的冷凍置換液處理后，用R221樹脂包埋。他們嘗試了多種電鏡成像策略，包括連續(xù)超薄切片TEM、陣列斷層掃描（收集在ITO導(dǎo)電玻璃上）以及聚焦離子束掃描電鏡（FIB-SEM）。雖然由于活細(xì)胞熒光成像的軸向分辨率限制以及冷凍置換導(dǎo)致的樣品收縮，將活細(xì)胞動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)與電鏡體積數(shù)據(jù)精確配準(zhǔn)存在挑戰(zhàn)，但研究團(tuán)隊(duì)通過后續(xù)的樹脂內(nèi)熒光顯微鏡檢查，在一個(gè)相對(duì)孤立的內(nèi)吞體追蹤案例中，成功地在陣列斷層掃描數(shù)據(jù)中找到了目標(biāo)內(nèi)吞體（盡管在Z軸深度上存在約500納米的偏差）。這證明了該工作流程具備從活體動(dòng)態(tài)追蹤到體積電鏡成像的全面能力。

研究結(jié)論與意義

本研究通過集成CryoCapsule、HPM Liveμ和R221樹脂三項(xiàng)核心技術(shù)，成功構(gòu)建了一個(gè)高度標(biāo)準(zhǔn)化和自動(dòng)化的Live-HPF-CLEM工作流程。該工作流程顯著提升了樣品制備的成功率和可靠性，將活細(xì)胞成像到高壓冷凍的時(shí)間關(guān)聯(lián)提升至秒級(jí)（<2秒），并實(shí)現(xiàn)了對(duì)快速動(dòng)態(tài)細(xì)胞事件（如內(nèi)吞體運(yùn)動(dòng)）的高置信度三維電鏡關(guān)聯(lián)分析。

討論部分指出，該技術(shù)的成功源于對(duì)每個(gè)環(huán)節(jié)的精細(xì)優(yōu)化：CryoCapsule的幾何優(yōu)化平衡了機(jī)械強(qiáng)度與熱傳導(dǎo)效率；HPM Liveμ的自動(dòng)化轉(zhuǎn)移消除了人為操作誤差；R221樹脂則在電鏡對(duì)比度和（潛在的）熒光保留之間取得了平衡。盡管目前活細(xì)胞熒光成像的分辨率（尤其是軸向）與體積電鏡數(shù)據(jù)之間的精確配準(zhǔn)仍存在挑戰(zhàn)（如Z軸偏差），但這項(xiàng)工作為克服這些挑戰(zhàn)提供了堅(jiān)實(shí)的技術(shù)平臺(tái)。它使得在接近生理狀態(tài)下捕獲細(xì)胞動(dòng)態(tài)事件并解析其納米尺度的超微結(jié)構(gòu)成為常規(guī)實(shí)驗(yàn)可能，極大地推動(dòng)了細(xì)胞動(dòng)力學(xué)、膜運(yùn)輸、細(xì)胞器互作等前沿領(lǐng)域的發(fā)展。未來，與更先進(jìn)的光學(xué)成像技術(shù)（如轉(zhuǎn)盤共聚焦、Airyscan、超分辨率顯微鏡）結(jié)合，將進(jìn)一步拓展該技術(shù)的應(yīng)用邊界。