高通量分離正常人及肺纖維化人肺泡上皮細(xì)胞新技術(shù)及其在疾病建模中的應(yīng)用

《Scientific Reports》：High-throughput isolation of normal and pulmonary fibrosis human alveolar epithelial cells

【字體： 大 中 小 】 時(shí)間：2025年12月05日 來(lái)源：Scientific Reports 3.9

　　

在人體肺部，肺泡是氣體交換的關(guān)鍵場(chǎng)所，其完整性由肺泡上皮細(xì)胞維持，其中肺泡2型(Alveolar Type 2, AT2)細(xì)胞不僅是分泌表面活性物質(zhì)的關(guān)鍵細(xì)胞，更被證實(shí)是肺泡區(qū)域的干/祖細(xì)胞，在肺泡穩(wěn)態(tài)維持和組織損傷修復(fù)中扮演著核心角色。因此，AT2細(xì)胞成為研究肺部生理、疾病機(jī)制（特別是特發(fā)性肺纖維化，Idiopathic Pulmonary Fibrosis, IPF）、藥物篩選乃至細(xì)胞治療的重要對(duì)象。然而，從人肺組織，尤其是病理狀態(tài)下的肺組織（如IPF）中，高效、高純度地分離出具有功能活性的原代AT2細(xì)胞，一直是該領(lǐng)域面臨的技術(shù)挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的熒光激活細(xì)胞分選(Fluorescence-Activated Cell Sorting, FACS)雖是金標(biāo)準(zhǔn)，但其通量低、耗時(shí)長(zhǎng)、設(shè)備依賴(lài)性強(qiáng)，難以滿(mǎn)足大規(guī)模下游應(yīng)用（如細(xì)胞治療所需的大量細(xì)胞）的需求。

為此，由Anthony L. Eiliazadeh、Golnaz Karoubi等領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)在《Scientific Reports》上發(fā)表了他們的最新研究成果。他們建立并優(yōu)化了一套完整的工作流程，結(jié)合高效的酶消化法和自動(dòng)化的磁激活細(xì)胞分選(Magnetic-Activated Cell Sorting, MACS)技術(shù)，成功實(shí)現(xiàn)了從健康人及IPF患者肺組織中高通量分離高純度、高活力的AT2細(xì)胞，并系統(tǒng)驗(yàn)證了分離細(xì)胞的功能特性，為肺部疾病研究提供了強(qiáng)大的技術(shù)平臺(tái)和細(xì)胞資源。

研究人員采用的關(guān)鍵技術(shù)方法主要包括：1）對(duì)來(lái)自多倫多總醫(yī)院肺移植項(xiàng)目的健康供體和IPF患者肺活檢組織進(jìn)行優(yōu)化后的酶（Dispase II和DNase I）消化和機(jī)械離散，以獲得單細(xì)胞懸液；2）使用autoMACS Pro Separator自動(dòng)化細(xì)胞分選儀，通過(guò)靶向AT2細(xì)胞特異性表面蛋白HTII-280進(jìn)行陽(yáng)性分選（一步法），或結(jié)合CD45陽(yáng)性細(xì)胞（白細(xì)胞）去除后再進(jìn)行HTII-280陽(yáng)性分選（兩步法）的策略來(lái)純化AT2細(xì)胞；3）利用流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估細(xì)胞純度和活力；4）將純化的AT2細(xì)胞在基質(zhì)膠中進(jìn)行3D肺泡球體培養(yǎng)，并通過(guò)形態(tài)學(xué)分析、免疫熒光染色、單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)和實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)等技術(shù)評(píng)估其干細(xì)胞特性、增殖能力、分化潛能及基因表達(dá)譜。

高效、可重復(fù)地從健康和病變肺組織中分離AT2細(xì)胞

研究結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)酶消化和機(jī)械離散后，平均每克健康肺組織可獲得約2.39 x 10⁷個(gè)細(xì)胞。經(jīng)過(guò)autoMACS分選，AT2細(xì)胞（定義為EPCAM⁺/HTII-280⁺細(xì)胞）的純度從分離前的平均17%（一步法）或23%（兩步法）顯著提升至85%（±7%）或95%（±3%）。兩步法獲得了更高且更穩(wěn)定的純度。細(xì)胞活力在分離過(guò)程中保持在較高水平（約92%）。AT2細(xì)胞得率在一步法和兩步法間無(wú)顯著差異。對(duì)于更具挑戰(zhàn)性的IPF肺組織，盡管每克組織初始細(xì)胞產(chǎn)量較低（平均8.8 x 10⁶個(gè)細(xì)胞/克），但經(jīng)過(guò)兩步法分選后，AT2細(xì)胞純度從9%大幅提高至90%（±7%），細(xì)胞活力平均為87%（±7%），每克組織可獲得2.2 x 10⁶個(gè)AT2細(xì)胞。這些數(shù)據(jù)證明了該方案對(duì)不同來(lái)源肺組織的適用性和有效性。

p<0.05,p<0.01,p<0.001,**p<0.0001 by Welch's two-tailed t-test(1-vs.2-step protocols) or paired two-tailed t-test(before vs. after separation).'>

分離的AT2細(xì)胞的3D培養(yǎng)

為了驗(yàn)證分離過(guò)程未損害細(xì)胞功能，研究人員將純化后的AT2細(xì)胞在3D基質(zhì)膠中進(jìn)行培養(yǎng)，形成肺泡球體。結(jié)果顯示，IPF來(lái)源的AT2細(xì)胞形成的球體在第14天的克隆形成效率(Colony-Forming Efficiency, CFE)和第28天的擴(kuò)增倍數(shù)均顯著低于健康來(lái)源的細(xì)胞，表明IPF AT2細(xì)胞自我更新和增殖能力受損。

在形態(tài)學(xué)上，健康肺泡球體通常表現(xiàn)為囊狀或致密折疊結(jié)構(gòu)，而IPF來(lái)源的球體則出現(xiàn)兼具兩種特征的混合形態(tài)，這是一種異常的組織方式。免疫熒光染色顯示，健康球體表達(dá)遠(yuǎn)端肺標(biāo)志物如HTII-280、水通道蛋白5(AQP5)和前表面活性蛋白C(Pro-SPC)，并存在活躍增殖（KI67陽(yáng)性）。相比之下，IPF來(lái)源的球體Pro-SPC表達(dá)顯著減少，HTII-280表達(dá)微弱，且缺乏KI67表達(dá)。尤為重要的是，一部分IPF球體在同一結(jié)構(gòu)中同時(shí)表達(dá)了近端氣道標(biāo)志物細(xì)胞角蛋白5(KRT5)和遠(yuǎn)端標(biāo)志物AQP5，呈現(xiàn)出一種"基底朝外"的異常極性。基因表達(dá)分析進(jìn)一步證實(shí)，IPF球體中遠(yuǎn)端標(biāo)志物如表面活性蛋白C(SFTPC)的表達(dá)下調(diào)，而近端氣道相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)。

研究結(jié)論與意義

本研究成功建立了一套高效、可靠的工作流程，用于從健康和IPF病變的人肺組織中高通量分離高純度、高活力的原代AT2細(xì)胞。該方案的核心優(yōu)勢(shì)在于其自動(dòng)化、高通量和可擴(kuò)展性，能夠產(chǎn)生足夠數(shù)量的細(xì)胞用于下游應(yīng)用，如疾病建模、藥物篩選和細(xì)胞治療開(kāi)發(fā)。更重要的是，利用該流程獲得的IPF來(lái)源的AT2細(xì)胞在3D培養(yǎng)體系中展現(xiàn)出顯著的功能缺陷，包括自我更新和增殖能力下降，以及異常的分化模式，表現(xiàn)為遠(yuǎn)端肺泡特性丟失和近端氣道特征獲得。這種異常的表型轉(zhuǎn)換，為理解IPF中上皮細(xì)胞功能障礙和再生修復(fù)失敗提供了直接的體外實(shí)驗(yàn)證據(jù)。綜上所述，該研究不僅提供了一項(xiàng)強(qiáng)大的技術(shù)工具，也為在體外模擬和研究肺纖維化等疾病的病理過(guò)程開(kāi)辟了新的途徑。