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AMPK通過激活自噬與脂肪酸氧化調控早期非酒精性脂肪肝發展的新機制

《Scientific Reports》：AMPK affects the development of early-stage NAFLD by activating autophagy and fatty acid oxidation

【字體：大中小】 時間：2025年12月05日 來源：Scientific Reports 3.9

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　　本研究針對早期非酒精性脂肪肝（NAFLD）發病機制不清的問題，開展了不同脂質積累程度對自噬和能量代謝通路影響的研究。研究發現適度脂質積累可激活AMPK，進而促進PPARα介導的脂肪酸氧化和自噬活性，揭示了一種早期NAFLD的代償機制，為早期干預提供了新靶點。

在當今社會，非酒精性脂肪肝病（NAFLD）已成為全球范圍內最常見的肝臟疾病之一，影響著約四分之一的人口。這種疾病譜系從單純的肝臟脂肪變性開始，可逐步進展為非酒精性脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化，甚至肝癌，嚴重威脅人類健康。近年來，學術界提出了“代謝功能障礙相關脂肪性肝病”（MASLD）這一新術語來描述這一疾病譜系，但為了保持文獻追溯的一致性和避免術語轉換帶來的混淆，本研究仍沿用“NAFLD”這一廣泛認知的名稱。

肝臟是機體脂質代謝的核心器官，通過精細的平衡調控維持著脂質穩態。這個平衡依賴于脂質合成與氧化分解的協調作用。其中，固醇調節元件結合蛋白-1c（SREBP-1c）、脂肪酸合酶（FAS）和乙酰輔酶A羧化酶（ACC）是調控脂質合成的關鍵分子。另一方面，過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）則是脂肪酸β-氧化的核心調控因子，它調控著肉堿棕櫚酰轉移酶1A（CPT1A）、CPT2、乙酰輔酶A氧化酶（ACO）等關鍵酶的表達。當這種平衡被打破，例如在肥胖或高脂血癥等代謝紊亂狀態下，甘油三酯（TG）的過量產生超過了肝臟的氧化能力，就會導致肝脂肪變性，這是NAFLD的早期標志。

然而，目前對NAFLD發病機制的研究多集中于“二次打擊”或“多重打擊”假說，即初始的肝脂肪變性（第一次打擊）使肝細胞對損傷的耐受性降低，繼而觸發氧化應激等“第二次打擊”，導致肝細胞損傷。一個關鍵的科學問題尚未被充分探討：不同程度的脂質積累（輕度 vs 重度）如何動態地影響SREBP-1c/FAS/ACC（合成）與PPARα（氧化）之間的平衡？肝細胞是否對“輕度脂質應激”和“嚴重脂質超載”表現出不同的應答？此外，自噬作為一種細胞自我保護機制，與NAFLD的形成和進展密切相關。在生理條件下，自噬通過清除多余的脂滴、錯誤折疊的蛋白質和受損的細胞器（如線粒體）來維持肝臟正常的脂質水平，并減少氧化應激，從而減輕肝細胞損傷。自噬失調會導致肝臟脂質堆積加劇，形成惡性循環，促進疾病發生發展。AMP激活的蛋白激酶（AMPK）是細胞能量代謝的核心調節器。AMPK的激活可以減少外周脂肪組織的脂肪酸釋放，抑制脂質合成，并促進脂質分解，從而減輕肝臟脂質堆積。研究表明，AMPK可以通過磷酸化下游靶點來增強自噬流，這通常表現為微管相關蛋白1輕鏈3（LC3B/LC3A）比值的增加和自噬底物P62表達的降低。

盡管AMPK/PPARα調控脂質代謝，以及自噬在NAFLD中的作用已被部分認知，但AMPK-自噬-PPARα軸在不同脂質積累水平下的動態變化，以及早期NAFLD是否存在代償機制，仍缺乏明確的證據。為了解決這些知識空白，金梅玉（Mei-yu Jin）、余浩（Hao Yu）、鄧瓊（Qiong Deng）、王竹（Zhu Wang）和梁慧（Hui Liang）的研究團隊在《Scientific Reports》上發表了他們的最新研究成果。本研究旨在闡明兩個關鍵問題：第一，通過油酸（OA）和棕櫚酸（PA）誘導細胞以及Tyloxapol（Ty）/高脂飲食（HFD）干預小鼠構建的低水平與經典脂質積累模型，是否表現出不同的脂質代謝和自噬模式？第二，適度的脂質積累是否會觸發AMPK磷酸化，從而調節PPARα介導的脂肪酸氧化和自噬激活？回答這些問題將為理解NAFLD的早期發病機制提供新的見解。

為了開展這項研究，研究人員運用了多種關鍵技術方法。他們分別在小鼠肝細胞系（AML12）和人肝癌細胞系（HepG2）中，使用不同濃度的OA和PA混合物在體外構建了低水平和高水平（經典）的脂質積累模型。在動物實驗中，他們通過腹腔注射不同劑量的Tyloxapol構建了急性低水平脂質積累小鼠模型，并通過飼喂4周和12周的高脂飲食（HFD）分別構建了慢性的低水平和經典脂質積累小鼠模型。研究過程中，他們采用細胞計數試劑盒-8（CCK-8）法檢測細胞活力，通過甘油三酯（TG）測定試劑盒量化細胞和肝臟組織中的脂質含量，并利用油紅O（Oil Red O）染色直觀顯示脂滴沉積情況。在分子機制探索層面，他們運用蛋白質印跡（Western Blot）技術檢測了PPARα、ACC、SREBP-1c等脂代謝相關蛋白以及ATG5、ATG7、LC3A/B、P62等自噬相關蛋白的表達和AMPK的磷酸化水平。同時，通過實時定量熒光PCR（qPCR）分析了相關基因的mRNA表達。此外，還使用ATP測定試劑盒評估了細胞的能量狀態，并通過免疫組織化學（IHC）技術在肝臟組織切片上觀察了自噬相關蛋白的定位和表達。

3.1 不同誘導條件導致不同程度的脂質積累

研究人員首先確定了不同濃度的OA和PA對AML12和HepG2細胞的毒性，發現所用濃度均無毒性作用。通過TG含量測定和油紅O染色，證實了100 μM或200 μM PA單獨處理，以及100 μM PA + 200 μM OA或200 μM PA + 400 μM OA聯合處理，均能在AML12和HepG2細胞中成功誘導脂質積累。有趣的是，qPCR和Western Blot結果顯示，這些低水平的脂質誘導條件不僅上調了脂質合成基因SREBP-1c、ACC、FAS的表達，同時也促進了脂肪酸氧化基因PPARα、ACO、CPT2、CPT1A的表達。在動物實驗中，腹腔注射300 mg/kg Tyloxapol（Ty）12小時后，小鼠肝臟也呈現出類似趨勢：脂質合成和氧化相關基因的mRNA和蛋白表達均被促進。這些結果表明，適度的脂質積累可以同時激活肝臟的脂質合成和氧化途徑，提示在早期NAFLD可能存在一種代償性應答。

3.2 不同水平的脂質積累影響自噬

接下來，研究團隊探討了脂質積累程度對自噬的影響。在AML12和HepG2細胞中，qPCR和Western Blot分析顯示，200 μM PA + 400 μM OA的處理顯著增加了自噬標志物LC3的mRNA和蛋白水平（LC3-II/LC3-I比值增加），同時降低了自噬底物P62的表達，自噬相關蛋白ATG5和ATG7的表達也增加。這表明低水平脂質積累激活了細胞自噬。在小鼠模型中，300 mg/kg Ty處理同樣增加了肝臟Lc3 mRNA表達，降低了p62表達，并且ATG5、ATG7和LC3A/B蛋白表達上調，P62下調，進一步證實了適度脂質積累可以激活肝臟自噬。

3.3 適度脂質積累促進脂質代謝

為了與經典的重度脂質積累模型進行對比，研究人員用更高濃度的330 μM PA + 660 μM OA處理細胞，并用12周HFD喂養小鼠。結果發現，與200 μM PA + 400 μM OA或4周HFD誘導的適度積累相比，重度積累模型（330 μM PA + 660 μM OA 和 12周HFD）導致了更嚴重的脂質沉積（油紅O染色和TG含量更高）。更重要的是，在分子水平上，低濃度PA+OA刺激或4周HFD能夠促進PPARα的表達，而高濃度PA+OA刺激或12周HFD則抑制了PPARα的表達，但依然促進ACC和SREBP-1c的表達。這清晰地表明，適度的脂質積累能夠同時上調脂肪酸氧化和合成，而重度的脂質積累則會抑制氧化能力，導致脂質凈沉積增加。

3.4 適度脂質積累誘導自噬激活

延續前面的發現，本研究進一步比較了不同脂質積累程度對自噬的差異化影響。Western Blot結果顯示，低濃度PA+OA（200 μM PA + 400 μM OA）刺激能夠促進ATG5、ATG7和LC3B的表達，表明自噬被激活。然而，高濃度PA+OA（330 μM PA + 660 μM OA）刺激雖然也增加了LC3B的表達，但P62的表達同時增加，這可能提示自噬流在重度積累下受阻。在體實驗也得到一致結果：4周HFD促進ATG5、ATG7和LC3B表達，而12周HFD在增加LC3B表達的同時也增加了P62的表達。肝臟組織的免疫組化結果直觀顯示，4周HFD和12周HFD都能促進LC3的表達，但只有12周HFD組同時增強了P62的陽性信號。這些結果共同說明，適度而非過度的脂質積累能夠有效激活自噬，而重度積累可能導致自噬功能紊亂。

3.5 適度脂質積累促進能量代謝

由于自噬激活與細胞能量穩態密切相關，研究人員檢測了能量代謝指標。他們發現，在低水平脂質積累的細胞模型（AML12, HepG2）和急性小鼠模型（Ty注射）中，ATP含量隨著脂質積累程度的增加而升高。同時，線粒體復合物I-IV（CO1, CO2, CO3, CO4）的mRNA表達水平也顯著上調。最關鍵的是，AMPKα和AMPKβ的磷酸化水平也隨著OA、PA和Ty濃度的增加而顯著增強。然而，在重度脂質積累條件下（330 μM PA + 660 μM OA 和 12周HFD），ATP含量則顯著下降。這些結果提示，適度的脂質積累能夠提升細胞的能量代謝水平，激活能量感受器AMPK，而這可能是其促進自噬的重要原因。

綜合以上研究結果，可以得出結論：在NAFLD的早期階段，適度的脂質積累能夠作為一種應激信號，激活能量代謝的核心調控因子AMPK。活化的AMPK進而可能通過兩條途徑發揮保護作用：一是上調PPARα及其下游脂肪酸氧化關鍵酶（如CPT1A、CPT2、ACO）的表達，增強脂肪酸的β-氧化；二是通過增加ATG5、ATG7表達和LC3-II/LC3-I比值、降低P62表達來激活自噬流，從而幫助清除多余的脂質。這種由AMPK介導的、同時增強脂肪酸氧化和自噬的代償性機制，有助于肝細胞應對初期的脂質負荷，可能延緩NAFLD向更嚴重階段發展。然而，當脂質積累超過一定閾值（如經典模型所示），這種代償機制可能被破壞，PPARα表達受抑制，自噬流可能受阻，最終導致脂質大量沉積和肝損傷。

本研究的發現填補了NAFLD研究領域的一個重要空白。以往的研究多聚焦于嚴重的脂質超載，而本研究通過設計低水平與經典脂質積累的對比模型，首次系統地揭示了AMPK-PPARα-自噬軸在早期NAFLD中的動態變化和代償作用，提出了“代償窗口期”的概念。這為在NAFLD早期進行干預，例如通過激活AMPK來增強機體的代償能力，提供了新的理論依據和潛在的靶點。當然，本研究也存在一些局限性，例如體外實驗主要使用細胞系而非原代肝細胞，且AMPK的核心作用主要基于相關性分析，未來需要通過基因敲除等功能性實驗進一步驗證。盡管如此，這項研究無疑增進了我們對NAFLD早期發病機制的理解，為開發新的防治策略指明了方向。

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