膽汁代謝物棕櫚酸通過ROS/NF-κB信號(hào)通路增強(qiáng)膽囊癌細(xì)胞遷移機(jī)制研究

《Scientific Reports》：Bile metabolite palmitic acid augments the migration of gallbladder cancer cells through the ROS/NF-кB signaling pathway

【字體： 大 中 小 】 時(shí)間：2025年12月05日 來源：Scientific Reports 3.9

　　

膽囊癌作為膽道系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展與多種風(fēng)險(xiǎn)因素密切相關(guān)，其中胰腺膽道反流（Pancreaticobiliary Reflux, PBR）被認(rèn)為是一個(gè)重要的致病因素。PBR會(huì)導(dǎo)致膽汁成分改變，產(chǎn)生包括激活的胰酶和次級(jí)膽汁酸在內(nèi)的致癌物質(zhì)，直接或間接損傷膽囊黏膜，誘發(fā)反復(fù)的損傷-修復(fù)循環(huán)，最終可能導(dǎo)致癌變。然而，PBR導(dǎo)致膽囊癌的具體分子機(jī)制尚未完全闡明。以往研究發(fā)現(xiàn)，PBR患者膽汁中的游離脂肪酸（Free Fatty Acids, FFAs）水平升高，且是膽囊壁增厚的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。其中，棕櫚酸（Palmitic Acid, PA）作為FFAs的主要成分，在PBR患者膽汁中顯著升高。已知PA在其他癌癥（如胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌）中能通過誘導(dǎo)活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）產(chǎn)生來促進(jìn)癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移，但其在膽囊癌中的作用尚不清楚。為此，段宣波（Xuanbo Da）、郭全宇（Quanyu Guo）、盧宇軒（Yuxuan Lu）等研究人員在《Scientific Reports》上發(fā)表了他們的研究成果，深入探討了PA如何影響膽囊癌細(xì)胞的遷移能力及其背后的信號(hào)通路。

研究人員主要運(yùn)用了細(xì)胞活力檢測(cè)（CCK-8法）、脂滴染色（油紅O染色）、細(xì)胞遷移能力評(píng)估（Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和小孔愈合實(shí)驗(yàn)）、細(xì)胞內(nèi)ROS和超氧陰離子自由基（O₂·^-）水平檢測(cè)（使用DCFH-DA和DHE熒光探針結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)）、蛋白質(zhì)和基因表達(dá)分析（蛋白質(zhì)印跡法Western Blot、定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)qRT-PCR）以及蛋白定位觀察（免疫熒光法Immunofluorescence）等關(guān)鍵技術(shù)方法。研究使用了兩種人膽囊癌細(xì)胞系NOZ和GBC-SD。

3.1 PA增強(qiáng)人膽囊癌細(xì)胞的遷移能力

研究人員首先用不同濃度的PA處理NOZ和GBC-SD細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)PA在0.4 mM和0.8 mM濃度下對(duì)細(xì)胞有明顯的毒性作用，但同時(shí)也觀察到細(xì)胞內(nèi)脂滴積累隨著PA濃度增加而增加。通過Transwell遷移實(shí)驗(yàn)，他們發(fā)現(xiàn)0.4 mM的PA能顯著增強(qiáng)NOZ和GBC-SD細(xì)胞的遷移能力。這表明PA能被膽囊癌細(xì)胞吸收，并在一定濃度下顯著促進(jìn)細(xì)胞遷移。

3.2 PA刺激導(dǎo)致NOZ和GBC-SD細(xì)胞中ROS水平上調(diào)和NF-κB信號(hào)通路激活

為了探究PA促進(jìn)遷移的機(jī)制，研究人員檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)ROS水平。結(jié)果顯示，0.4 mM PA處理能顯著增加NOZ和GBC-SD細(xì)胞中ROS和O₂·^-的水平。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PA刺激還導(dǎo)致了核因子κB（NF-κB）的關(guān)鍵亞基p65發(fā)生明顯的核轉(zhuǎn)位，表明NF-κB信號(hào)通路被激活。

3.3 NAC抑制PA誘導(dǎo)的ROS水平上調(diào)和NRF2/ARE信號(hào)通路的激活

ROS的過量產(chǎn)生通常會(huì)激活細(xì)胞內(nèi)的抗氧化防御機(jī)制。研究人員使用ROS抑制劑N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine, NAC）進(jìn)行處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NAC能有效抑制PA引起的ROS和O₂·^-水平升高。同時(shí)，免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明，PA處理能增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子NRF2及其下游靶基因血紅素加氧酶-1（HO-1）和醌氧化還原酶1（NQO1）的熒光強(qiáng)度，即激活了NRF2/ARE信號(hào)通路，而NAC干預(yù)則抑制了NRF2的核轉(zhuǎn)位及其下游靶基因的表達(dá)。這表明PA可能通過上調(diào)ROS水平激活NRF2/ARE這一抗氧化通路。

3.4 ROS下調(diào)抑制NF-κB激活和膽囊癌細(xì)胞遷移

為了明確ROS在PA誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移中的具體作用，研究人員在加入PA的同時(shí)使用NAC進(jìn)行處理。結(jié)果顯示，NAC預(yù)處理能夠逆轉(zhuǎn)PA引起的促炎細(xì)胞因子白介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達(dá)的上調(diào)，并抑制NF-κB p65的核轉(zhuǎn)位及其磷酸化水平。更重要的是，在蛋白和mRNA水平上，NAC顯著降低了PA誘導(dǎo)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）標(biāo)志蛋白N-鈣黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)了E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達(dá)。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和小孔愈合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均證實(shí)，NAC能顯著抑制PA誘導(dǎo)的NOZ和GBC-SD細(xì)胞遷移。這些結(jié)果表明，PA誘導(dǎo)的ROS上調(diào)是促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞遷移的關(guān)鍵因素。

綜上所述，本研究闡明了膽汁代謝物PA通過誘導(dǎo)ROS過度產(chǎn)生，進(jìn)而激活NF-κB信號(hào)通路和NRF2/ARE信號(hào)通路，最終促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞發(fā)生EMT并增強(qiáng)其遷移能力的分子機(jī)制。NF-κB的激活觸發(fā)了炎癥因子釋放和EMT進(jìn)程，而NRF2/ARE通路的激活可能作為一種細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)，幫助癌細(xì)胞在高ROS環(huán)境下存活，兩者協(xié)同作用增強(qiáng)了膽囊癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能。該研究從代謝角度揭示了PBR與膽囊癌發(fā)生發(fā)展之間的潛在聯(lián)系，闡明了PA作為膽囊癌早期轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)因素的作用機(jī)制，不僅深化了對(duì)PBR相關(guān)膽囊疾病分子機(jī)制的理解，也為開發(fā)針對(duì)該通路的新型治療策略提供了重要的科學(xué)依據(jù)。