KY216-微管蛋白復(fù)合物捕獲VASH2抑制非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移的新機(jī)制
《Nature Communications》：KY216-tubulin complex captures VASH2 to inhibit NSCLC metastasis
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時間：2025年12月05日
來源：Nature Communications 15.7
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本研究針對非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)轉(zhuǎn)移難題，通過解析KY216與αβ-微管蛋白復(fù)合物的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該復(fù)合物可增強(qiáng)VASH2與α-微管蛋白結(jié)合，促進(jìn)微管去酪氨酸化，同時通過上調(diào)miR-429抑制VASH2/ZEB1軸，雙重調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程。該研究為微管靶向藥物(MTAs)的抗轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了新見解，發(fā)表于《Nature Communications》。
肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因，其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是最常見的類型。盡管在預(yù)防、檢測和治療方面取得了進(jìn)展，但轉(zhuǎn)移仍然是NSCLC患者死亡的主要原因。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)是癌細(xì)胞通過血液或淋巴系統(tǒng)擴(kuò)散到肺、肝、腦和骨骼等器官，這給治療帶來了重大挑戰(zhàn)，并顯著降低了患者的生存率。因此，深入研究NSCLC的轉(zhuǎn)移途徑和關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，對于開發(fā)藥物、改善治療效果以及提高患者的生活質(zhì)量和預(yù)后至關(guān)重要。
微管是真核細(xì)胞中的重要組成部分，在維持結(jié)構(gòu)、物質(zhì)運(yùn)輸、染色體分離、細(xì)胞分裂和運(yùn)動等多種細(xì)胞活動中起著關(guān)鍵作用。微管由α-微管蛋白和β-微管蛋白形成異源二聚體。癌細(xì)胞的生長依賴于微管二聚體的動態(tài)聚合和解聚過程，這些二聚體經(jīng)歷去酪氨酸化、乙酰化、多聚谷氨酰胺化和多聚腺苷酸化等翻譯后修飾。這些修飾存在于腫瘤組織中，并與癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程相關(guān)。靶向這些動態(tài)過程已被證明是開發(fā)抗癌藥物的有效策略。
微管靶向藥物(MTAs)根據(jù)其作用分為微管穩(wěn)定劑(MSAs)，如紫杉醇，和微管去穩(wěn)定劑(MDAs)，如秋水仙素和康普瑞汀A-4(CA-4)。這些藥物通過靶向特定的結(jié)合位點(diǎn)破壞癌細(xì)胞的有絲分裂，從而顯著抑制癌細(xì)胞的生長。此外，它們還表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗轉(zhuǎn)移活性。然而，關(guān)于它們對癌細(xì)胞遷移影響的機(jī)制仍不確定，需要進(jìn)一步研究。
血管抑制素2(VASH2)最初在血管生成芽尖部的浸潤性單核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，在促進(jìn)血管生成中發(fā)揮作用。VASH2已被證明在結(jié)直腸癌、肝細(xì)胞癌、胰腺癌和卵巢癌等多種癌癥中強(qiáng)烈誘導(dǎo)EMT和血管生成。在肝細(xì)胞癌(HCC)中，VASH2通過激活ZEB1啟動子上調(diào)鋅指E盒結(jié)合同源框蛋白1(ZEB1)的表達(dá)來促進(jìn)轉(zhuǎn)移。最近的研究表明，VASH2的高表達(dá)與肺鱗狀細(xì)胞癌患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)，并在體內(nèi)促進(jìn)肺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。作為第一個被發(fā)現(xiàn)的去酪氨酸酶，VASH2還控制著α-微管蛋白的去酪氨酸化。VASH2具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶樣功能，并在催化反應(yīng)中作為半胱氨酸蛋白酶，具有非經(jīng)典的Cys-His-Ser催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)。VASH2包含一個N端結(jié)構(gòu)域(NTD)和一個C端結(jié)構(gòu)域(CTD)，Cys-His-Ser催化三聯(lián)體口袋位于這兩個結(jié)構(gòu)域中，并帶有強(qiáng)正電荷。這種正電特性識別帶負(fù)電荷的α-微管蛋白尾部，并在催化口袋中促進(jìn)α-微管蛋白的去酪氨酸化。考慮到VASH2在血管生成、癌癥遷移和微管蛋白翻譯后修飾中的關(guān)鍵作用，進(jìn)一步研究其對肺癌的影響具有重要的生物學(xué)意義。
哺乳動物微RNA(miRNAs)通過結(jié)合靶信使RNA(mRNA)的3'非翻譯區(qū)(UTR)在調(diào)控基因表達(dá)中起關(guān)鍵作用，導(dǎo)致mRNA不穩(wěn)定和翻譯抑制。具體而言，miR-200家族靶向ZEB1/ZEB2 mRNA以抑制多種癌細(xì)胞中的EMT。在肺癌中，miR-200家族表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗轉(zhuǎn)移和抗血管生成作用。研究表明，NSCLC患者血清中miR-429水平降低，并且在轉(zhuǎn)移性肺腺癌小鼠模型中顯著抑制。miR-429的低表達(dá)與NSCLC患者較短的總生存期(OS)和無病生存期(DFS)密切相關(guān)。此外，miR-429已被證明可抑制A549細(xì)胞的遷移。
本研究解析了MTA KY216與微管蛋白秋水仙素結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的高分辨率X射線晶體結(jié)構(gòu)，并證實(shí)了KY216在體外和體內(nèi)抑制NSCLC生長和轉(zhuǎn)移的功效。機(jī)制研究表明，KY216通過增強(qiáng)VASH2/α-微管蛋白相互作用和增加miR-429水平來抑制VASH2/ZEB1誘導(dǎo)的EMT過程，最終限制NSCLC的轉(zhuǎn)移。
本研究主要采用了以下關(guān)鍵技術(shù)方法：通過X射線晶體學(xué)解析了KY216與T2R-TTL微管蛋白復(fù)合物的高分辨率結(jié)構(gòu)；利用等溫滴定量熱法(ITC)分析了KY216與微管蛋白的結(jié)合親和力以及KY216對VASH2-微管蛋白相互作用的調(diào)控；通過免疫共沉淀(Co-IP)和鄰近連接 assay(PLA)檢測了VASH2與α-微管蛋白的相互作用；利用RNA測序(RNA-seq)和microRNA測序(miRNA-seq)分析了KY216處理后的基因表達(dá)譜變化；通過體外細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)(如Transwell assay)評估了KY216對NSCLC細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響；并構(gòu)建了裸鼠異位移植模型和心內(nèi)注射轉(zhuǎn)移模型進(jìn)行體內(nèi)藥效驗(yàn)證。研究中使用的75例NSCLC患者組織樣本來源于上海肺科醫(yī)院。
高分辨率X射線晶體結(jié)構(gòu)顯示KY216與微管蛋白秋水仙素位點(diǎn)結(jié)合
研究人員解析了KY216與T2R-TTL復(fù)合物（包含兩個α/β-微管蛋白異源二聚體、stathmin樣蛋白RB3和微管蛋白酪氨酸連接酶）結(jié)合的高分辨率X射線晶體結(jié)構(gòu)（PDB代碼8YRK），分辨率達(dá)到2.7 ?。結(jié)構(gòu)分析表明，KY216占據(jù)了由β-微管蛋白的S8、S9和S10鏈、T7環(huán)、H7和H8螺旋以及α-微管蛋白的T5環(huán)形成的秋水仙素結(jié)合位點(diǎn)。KY216的三取代苯環(huán)上的氯原子通過形成鹵鍵與βVal236的主鏈羰基緊密結(jié)合，增強(qiáng)了其與β-微管蛋白的結(jié)合穩(wěn)定性。此外，KY216的D環(huán)羰基與βAsp249的酰胺基團(tuán)形成經(jīng)典氫鍵，并與βAla248形成非經(jīng)典氫鍵。與微管蛋白-鬼臼毒素復(fù)合物結(jié)構(gòu)比較顯示高度重疊，證實(shí)了KY216結(jié)合模式的準(zhǔn)確性。與未結(jié)合的直鏈微管蛋白二聚體（PDB代碼7TQY）的比較表明，KY216阻止了T7環(huán)的構(gòu)象變化，從而抑制了微管蛋白從彎曲構(gòu)象向直鏈構(gòu)象的轉(zhuǎn)變，阻礙了微管組裝。
KY216在體外和體內(nèi)抑制NSCLC進(jìn)展
KY216對肺癌細(xì)胞系的半數(shù)抑制濃度(IC50)約為20 nM，比對乳腺癌、結(jié)直腸癌和骨肉瘤細(xì)胞系的抑制作用更強(qiáng)。免疫熒光分析顯示，KY216以濃度依賴的方式破壞NCI-H460細(xì)胞的微管網(wǎng)絡(luò)。克隆形成和EDU實(shí)驗(yàn)表明，較低濃度的KY216即可顯著降低肺癌細(xì)胞的增殖能力。低濃度KY216誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞G2/M期阻滯，并降低G2/M期相關(guān)蛋白水平。此外，KY216處理后的NCI-H460和95-D細(xì)胞的條件培養(yǎng)基顯著影響人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的管腔形成能力，并降低血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的分泌。在裸鼠NCI-H460異種移植模型中，KY216（5、10或20 mg/kg，隔日給藥，持續(xù)14天）顯著抑制腫瘤生長，且不影響小鼠體重。免疫組化分析顯示，KY216治療后，細(xì)胞增殖指標(biāo)Ki67和血管生成指標(biāo)CD31陽性細(xì)胞比例顯著降低。組織病理學(xué)檢查表明KY216對主要器官無顯著毒性。
KY216抑制高轉(zhuǎn)移性肺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移
研究人員評估了KY216對兩種NSCLC細(xì)胞系（NCI-H460和95-D）轉(zhuǎn)移能力的影響。Transwell實(shí)驗(yàn)表明，95-D細(xì)胞具有更高的遷移和侵襲能力。TGF-β（10 ng/mL）處理增強(qiáng)了NCI-H460細(xì)胞的遷移和侵襲能力，并上調(diào)了波形蛋白、N-鈣黏蛋白等間質(zhì)標(biāo)志物和p-Smad2的水平。KY216能夠有效逆轉(zhuǎn)TGF-β誘導(dǎo)的這些變化，抑制細(xì)胞遷移和侵襲，降低間質(zhì)蛋白和p-Smad2的表達(dá)。同樣，KY216抑制高轉(zhuǎn)移潛能的95-D細(xì)胞的遷移和侵襲，降低波形蛋白、N-鈣黏蛋白和ZEB1的水平，同時增加E-鈣黏蛋白的表達(dá)。免疫熒光顯示KY216增強(qiáng)了E-鈣黏蛋白在細(xì)胞膜上的定位，增強(qiáng)了細(xì)胞間粘附。
通過RNA-seq分析KY216處理的肺癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)VASH2和ZEB1顯著下調(diào)。KY216以濃度依賴的方式降低VASH2水平。利用小干擾RNA(siRNAs)敲低VASH2表達(dá)，顯著降低了NCI-H460和95-D細(xì)胞的血管生成能力以及VEGF分泌，并削弱了細(xì)胞的遷移和侵襲能力，同時上調(diào)E-鈣黏蛋白，下調(diào)波形蛋白、N-鈣黏蛋白、ZEB1和p-Smad2。相反，過表達(dá)VASH2則增強(qiáng)細(xì)胞的血管生成能力、遷移和侵襲能力，上調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物和ZEB1，下調(diào)E-鈣黏蛋白。VASH2過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)KY216對TGF-β誘導(dǎo)的H460和95-D細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用，以及KY216對EMT標(biāo)志物表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。敲低VASH2則增強(qiáng)了KY216對TGF-β誘導(dǎo)的遷移和侵襲的抑制作用。
KY216促進(jìn)VASH2與α-微管蛋白結(jié)合從而促進(jìn)微管去酪氨酸化
盡管KY216降低了VASH2的表達(dá)，但Western blotting和免疫熒光實(shí)驗(yàn)意外地發(fā)現(xiàn)，KY216處理增加了NCI-H460和95-D細(xì)胞中微管的去酪氨酸化水平。免疫共沉淀(Co-IP)和鄰近連接 assay(PLA)結(jié)果表明，KY216顯著增強(qiáng)了VASH2與α-微管蛋白的相互作用。ITC實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，KY216特異性地與微管蛋白高親和力結(jié)合（Kd= 0.15 ± 0.01 μM），而不與VASH2直接結(jié)合。在維持KY216濃度平衡的體系中，KY216使VASH2與微管蛋白的結(jié)合親和力提高了約2.9倍（Kd從1.53 ± 0.22 μM降至0.52 ± 0.10 μM），結(jié)合自由能（ΔG）降低，表明KY216穩(wěn)定了VASH2-微管蛋白復(fù)合物。與其他MTAs相比，紫杉醇也能抑制VASH2表達(dá)，促進(jìn)α-微管蛋白去酪氨酸化，并增強(qiáng)VASH2與α-微管蛋白的相互作用；而康普瑞汀A-4(CA-4)則顯著降低VASH2水平，減少α-微管蛋白去酪氨酸化，且對VASH2-微管蛋白相互作用影響不大。ITC顯示CA-4與微管蛋白的結(jié)合親和力（Kd= 0.4 ± 0.05 μM）低于KY216，且CA-4存在下VASH2與微管蛋白的結(jié)合親和力與基線水平無顯著差異，表明KY216能誘導(dǎo)微管蛋白發(fā)生更利于VASH2結(jié)合的構(gòu)象變化。
KY216通過促進(jìn)VASH2與α-微管蛋白結(jié)合抑制EMT
基于晶體結(jié)構(gòu)分析、Co-IP和ITC實(shí)驗(yàn)結(jié)果，研究人員深入探討了KY216增強(qiáng)VASH2與微管蛋白相互作用并促進(jìn)微管去酪氨酸化這一機(jī)制如何影響NSCLC的EMT過程。研究發(fā)現(xiàn)，KY216處理顯著促進(jìn)了微管去酪氨酸化，并伴隨ZEB1表達(dá)下調(diào)。在VASH2敲低模型中，KY216逆轉(zhuǎn)了siVASH2對微管去酪氨酸化的抑制作用，并與siVASH2協(xié)同抑制ZEB1。在VASH2過表達(dá)模型中，KY216與過表達(dá)的VASH2協(xié)同升高微管去酪氨酸化水平，并有效抵消VASH2過表達(dá)引起的ZEB1異常上調(diào)。時序分析表明，KY216處理24小時后即可觀察到VASH2與α-微管蛋白相互作用的增強(qiáng)；處理48小時后，相互作用進(jìn)一步增強(qiáng)，沉淀物中檢測到更多去酪氨酸化微管，Input樣品中去酪氨酸化微管增加，ZEB1表達(dá)顯著下降；上述效應(yīng)在72小時達(dá)到峰值。為了進(jìn)一步闡明關(guān)系，研究人員構(gòu)建了催化三聯(lián)體位點(diǎn)突變（C158A/H193A/S210A）的VASH2質(zhì)粒。突變體（特別是S210位點(diǎn)突變）顯著削弱了VASH2與α-微管蛋白的相互作用，并導(dǎo)致去酪氨酸化水平下降。有趣的是，即使VASH2與α-微管蛋白的結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變，其上調(diào)ZEB1的能力仍不受影響。KY216處理能夠阻斷VASH2對ZEB1的激活，從而降低NSCLC細(xì)胞的遷移和侵襲能力；但當(dāng)VASH2的S210位點(diǎn)突變時，KY216的這種抑制作用被逆轉(zhuǎn)，且其促進(jìn)微管去酪氨酸化的能力受損。Co-IP實(shí)驗(yàn)揭示，S210位點(diǎn)突變損害了KY216對VASH2與α-微管蛋白結(jié)合的促進(jìn)作用，從而阻礙了VASH2的去酪氨酸化活性，并增強(qiáng)了其激活ZEB1的效應(yīng)。作為對照，CA-4無論S210突變是否存在，均不影響VASH2與微管蛋白的相互作用，且CA-4單獨(dú)處理抑制α-微管蛋白去酪氨酸化，此效應(yīng)在S210突變后不受影響。綜上所述，KY216通過招募VASH2，增強(qiáng)其與α-微管蛋白的相互作用，促進(jìn)微管去酪氨酸化，并抑制ZEB1表達(dá)，從而有效降低VASH2促進(jìn)EMT的活性。
KY216至少部分通過miR-429/VASH2/ZEB1軸抑制EMT
KY216不僅降低了VASH2和ZEB1的蛋白水平，也顯著降低了它們的mRNA水平。通過miRNA-seq，研究人員發(fā)現(xiàn)KY216處理NCI-H460細(xì)胞后，miRNA表達(dá)譜發(fā)生明顯改變。KEGG和GO富集分析表明，差異表達(dá)的miRNAs顯著富集于TGF-β信號通路并參與EMT過程。在眾多差異表達(dá)的miRNAs中，研究人員聚焦于與EMT相關(guān)的miR-663b、miR-5699-3p和miR-429。qRT-PCR證實(shí)，與miR-663b和miR-5699-3p相比，KY216處理后miR-429的表達(dá)上調(diào)最為顯著。KY216在TGF-β誘導(dǎo)的H460細(xì)胞中也顯著增強(qiáng)了miR-429的表達(dá)。Kaplan-Meier生存分析顯示，miR-429高表達(dá)與NSCLC患者的總生存期呈正相關(guān)。進(jìn)一步分析顯示，miR-429與VASH2之間存在顯著的負(fù)相關(guān)。過表達(dá)miR-429導(dǎo)致VASH2和ZEB1的mRNA水平顯著下調(diào)。通過miRDB、TargetScan和starBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測，在VASH2的3' UTR區(qū)域存在5個潛在的miR-429結(jié)合位點(diǎn)（A/C/D/E）。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)表明，miR-429過表達(dá)顯著降低了野生型C/D位點(diǎn)報告基因的活性，而C/D位點(diǎn)的突變質(zhì)粒能夠逆轉(zhuǎn)miR-429引起的熒光素酶活性降低，A位點(diǎn)的活性則不受影響，證明VASH2是miR-429的靶基因，且C/D位點(diǎn)是最重要的結(jié)合位點(diǎn)。功能上，過表達(dá)miR-429明顯抑制了TGF-β處理的H460和95-D細(xì)胞的遷移和侵襲能力，上調(diào)上皮標(biāo)志物，下調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物、ZEB1和p-Smad2；而轉(zhuǎn)染miR-429抑制劑則產(chǎn)生相反效果。使用miR-429抑制劑抵消KY216誘導(dǎo)的miR-429升高后，KY216對TGF-β誘導(dǎo)的NCI-H460和95-D細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用被逆轉(zhuǎn)，其對EMT標(biāo)志物表達(dá)的調(diào)節(jié)作用也被逆轉(zhuǎn)。此外，過表達(dá)miR-429與KY216聯(lián)合表現(xiàn)出協(xié)同抑制作用，共同抑制VASH2表達(dá)，抑制間質(zhì)標(biāo)志物，促進(jìn)上皮標(biāo)志物，從而阻礙NSCLC的EMT過程。綜合生物信息學(xué)分析還發(fā)現(xiàn)，除VASH2和ZEB1外，KY216/miR-429調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中還涉及SEMA6D、ZNF217、CREB5和MAP3K1等20個潛在miR-429靶基因，這些基因已被證實(shí)分別在乳腺癌、前列腺癌、肝細(xì)胞癌和NSCLC中促進(jìn)EMT，提示KY216可能通過miR-429介導(dǎo)的多靶點(diǎn)協(xié)同調(diào)控網(wǎng)絡(luò)抑制EMT。
KY216對NSCLC體內(nèi)轉(zhuǎn)移的抑制作用依賴于VASH2
對75例肺癌患者組織（35例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，40例原發(fā)性腫瘤）的免疫熒光分析顯示，VASH2的綠色熒光強(qiáng)度與N-鈣黏蛋白的紅色熒光強(qiáng)度呈顯著正相關(guān)，且在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者樣本中（如患者15）兩者表達(dá)均顯著升高，而無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、惡性程度較低的樣本（如患者36）中兩者表達(dá)均明顯降低。患者生存分析表明，VASH2高表達(dá)的患者生存時間更短。通過心內(nèi)注射95-D-luc肺癌細(xì)胞建立裸鼠肺癌轉(zhuǎn)移模型，系統(tǒng)性給予重組腺相關(guān)病毒(AAV)誘導(dǎo)VASH2過表達(dá)，隨后隔日給予KY216（20 mg/kg）治療。活體成像顯示，與對照組相比，AAV-OE-VASH2組小鼠腦和骨轉(zhuǎn)移增加，而KY216給藥減少了這些組織中的生物發(fā)光信號；然而，VASH2過表達(dá)削弱了KY216的抑制作用。H&E染色組織學(xué)分析證實(shí)，VASH2過表達(dá)增加了腦和骨中轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量，KY216治療減少了這些轉(zhuǎn)移灶，但其效果被VASH2過表達(dá)所抵消。這些發(fā)現(xiàn)證明VASH2過表達(dá)在體內(nèi)促進(jìn)NSCLC轉(zhuǎn)移，并減弱了KY216對轉(zhuǎn)移的抑制作用。
本研究揭示了KY216通過結(jié)合微管蛋白并形成復(fù)合物破壞微管結(jié)構(gòu)，從而阻滯NSCLC細(xì)胞于G2/M期，有效抑制其增殖。更重要的是，KY216-微管蛋白復(fù)合物通過增強(qiáng)VASH2與α-微管蛋白的相互作用，促進(jìn)后者去酪氨酸化，抑制ZEB1的功能，從而有效抑制NSCLC的轉(zhuǎn)移。此外，KY216誘導(dǎo)的miR-429部分增強(qiáng)了這些效應(yīng)。
在討論部分，作者指出KY216通過占據(jù)微管秋水仙素位點(diǎn)抑制微管組裝，并有效阻止αβ-異源二聚體向活性直鏈構(gòu)象的轉(zhuǎn)變。與先導(dǎo)化合物鬼臼毒素相比，KY216經(jīng)過結(jié)構(gòu)修飾降低了毒性并提高了抗癌功效。KY216除了疏水相互作用外，還與β-微管蛋白形成四個氫鍵和一個鹵鍵，從而增強(qiáng)了結(jié)合穩(wěn)定性和效力。這為設(shè)計和開發(fā)靶向微管蛋白秋水仙素位點(diǎn)的抗癌劑提供了寶貴的結(jié)構(gòu)信息。MTAs是癌癥治療的重要手段，但它們的理化性質(zhì)、生物利用度、毒性以及多藥耐藥性(MDR)的發(fā)展限制了其療效。作為秋水仙素結(jié)合位點(diǎn)抑制劑家族的一員，KY216可能通過結(jié)合P-糖蛋白(P-gp)發(fā)揮其耐藥逆轉(zhuǎn)作用。此外，KY216的相互作用位點(diǎn)避開了已知的紫杉醇耐藥相關(guān)突變位點(diǎn)，并可能比秋水仙素具有更低的耐藥傾向。本研究證實(shí)KY216在NSCLC中表現(xiàn)出顯著功效，能有效抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、抑制異種移植瘤模型中的腫瘤生長，且與紫杉醇相比毒性更低、療效增強(qiáng)。KY216的高效、低毒和克服紫杉醇耐藥潛力使其成為NSCLC治療的有前景的候選藥物。然而，該化合物在NSCLC中的耐藥譜仍需通過系統(tǒng)的體外和體內(nèi)研究來闡明。
NSCLC的轉(zhuǎn)移是患者死亡的主要原因，而TGF-β信號通路是調(diào)控此過程的關(guān)鍵通路之一。本研究表明，KY216可部分通過miR-429/VASH2軸抑制TGF-β信號通路，這通過p-Smad2蛋白和EMT標(biāo)志物的檢測得到證實(shí)。KY216直接抑制高侵襲性95-D細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能，并在兩種細(xì)胞類型中均證明其至少部分通過調(diào)控miR-429/VASH2/ZEB1通路抑制NSCLC轉(zhuǎn)移。KY216可能通過多靶點(diǎn)的協(xié)同作用抑制EMT，但當(dāng)前研究在多靶點(diǎn)功能驗(yàn)證方面存在局限，例如KY216/miR-429調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中SEMA6D、ZNF217、CREB5和MAP3K1等基因的分子功能亟待驗(yàn)證。
微管蛋白的翻譯后修飾包括對微管蛋白異源二聚體或游離微管蛋白的化學(xué)修飾。α-微管蛋白C末端酪氨酸的循環(huán)去除和再添加（去酪氨酸/酪氨酸循環(huán)）調(diào)節(jié)α-和β-微管蛋白的聚合，該循環(huán)失衡導(dǎo)致的功能缺陷可促進(jìn)染色體不穩(wěn)定和腫瘤轉(zhuǎn)移。微管去酪氨酸化能穩(wěn)定微管，通常與癌癥生長相關(guān)。然而，本研究發(fā)現(xiàn)，在KY216存在下，該化合物與α-和β-微管蛋白二聚體結(jié)合，阻礙其從彎曲構(gòu)象向直鏈構(gòu)象的轉(zhuǎn)變，從而 dramatically 阻礙微管組裝。基于ITC實(shí)驗(yàn)證據(jù)，KY216能夠穩(wěn)定VASH2-微管蛋白復(fù)合物，且與康普瑞汀A-4相比，VASH2對識別KY216-微管蛋白復(fù)合物表現(xiàn)出更高的偏好性。在微管組裝受損的系統(tǒng)中，VASH2仍能特異性識別與KY216結(jié)合的微管蛋白并催化去酪氨酸化。但由于微管蛋白二聚體無法形成基本的微管結(jié)構(gòu)，這種修飾無法轉(zhuǎn)化為微管穩(wěn)定效應(yīng)。總之，KY216不僅通過阻礙微管組裝發(fā)揮藥理作用，還通過增強(qiáng)VASH2與α-微管蛋白的結(jié)合、減少VASH2對ZEB1的促進(jìn)作用來抑制細(xì)胞遷移。值得注意的是，盡管康普瑞汀A-4、紫杉醇和KY216都屬于MTAs并能抑制VASH2，但它們在對去酪氨酸化的調(diào)控效果上存在差異：CA-4不影響VASH2與微管蛋白的相互作用；紫杉醇能促進(jìn)這種相互作用并增加去酪氨酸化，但其對ZEB1的調(diào)控作用是否與KY216一致尚需進(jìn)一步研究。本研究揭示了KY216調(diào)控微管去酪氨酸化和ZEB1表達(dá)的具體作用機(jī)制；但由于化合物結(jié)構(gòu)差異，其他MTAs可能通過不同的機(jī)制發(fā)揮作用，這有待進(jìn)一步探索。
miR-429在不同癌癥中的作用復(fù)雜多樣。例如，在乳腺癌中，有研究發(fā)現(xiàn)miR-429通過抑制FN1阻礙Wnt/β-catenin通路，導(dǎo)致MDA-MB-231細(xì)胞增殖和遷移減少；而另一項(xiàng)研究則觀察到miR-429實(shí)際上促進(jìn)了HER2+ BC SKBR-3細(xì)胞的增殖和遷移。在NSCLC中，有研究顯示miR-429促進(jìn)A549細(xì)胞增殖和遷移，并在患者血清中檢測到其水平升高，這與之前的報道相矛盾。本研究證明，在NCI-H460和95-D細(xì)胞中，miR-429通過抑制VASH2和ZEB1表達(dá)來抑制EMT。Kaplan-Meier分析表明miR-429高水平與肺癌患者生存改善相關(guān)。這些差異凸顯了需要進(jìn)一步研究以澄清miR-429的確切作用。此外，本研究觀察到KY216上調(diào)miR-429，以及微管靶向藥物上調(diào)miR-200家族成員。不同藥物特異性上調(diào)miRNAs的機(jī)制值得在未來研究中深入探討。
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